Картирование распределения медиаторов: общие сведения
Одним из подходов, используемых для визуализации нейронов, которые высвобождают какие-либо медиаторы в ЦНС, является картирование распределения нейронов методами гистологии или иммуногистохимии. Флуоресцентнный метод Фалька и Хиллярпа позволяет метить нейроны, содержащие биогенные амины , такие как дофамин , норадреналин и 5-гидрокситриптамин . После конденсации с формальдегидом каждое из этих веществ при облучении ультрафиолетом начинает испускать свет с характерной длиной волны ( рис. 14.2 ).
Для небольших молекул нейромедиаторов, таких как ГАМК , 5-НТ , дофамин и нейропептиды , были созданы специфичные антитела . Антитела напрямую или через промежуточные звенья соединяют с маркерами, которые могут быть обнаружены методами световой, флуоресцентной или электронной микроскопии. Клонирование кДНК нейропептидов и гибридизация in situ , дали дополнительные возможности в исследованиях регуляции экспрессии пептидов и идентификации нейронов, синтезирующих нейропептиды.
Альтернативой методам мечения самих медиаторов является создание специфических зондов для определения ферментов, осуществляющих синтез и деградацию медиаторов. Нейроны содержат большое число ферментов, катализирующих синтез тех медиаторов, которые высвобождаются этими нейронами.
Например, нейроны, использующие в качестве медиатора ГАМК, имеют высокий уровень декарбоксилазы глутаминовой кислоты . Антитела к этому ферменту были использованы для обнаружения ГАМК-содержащих нейронов .
Антитела к холинацетилтрансферазе метят холинергические нейроны , в то время как антитела к тирозингидроксилазе и дофамин-бета-гидроксилазе выявляют клетки, высвобождающие дофамин и норадреналин .
Для многих ферментов, участвующих в синтезе нейромедиаторов, клонирована комплементарная ДНК . Регуляция и локализация мРНК этих ферментов были изучены методами гибридизации in situ . Ферменты, участвующие в распадe медиатора, в меньшей степени подходят для его идентификации. В то же время при определенных условиях ферменты, разрушающие ацетилхолин и ГАМК, могут быть использованы в качестве подходящих маркеров этих медиаторов.
Химическая природа синапсов может быть также установлена зондами, распознающих рецепторы на постсинаптических клетках . Например, моноклональные антитела к рецепторам ГАМК были использованы для локализации синапсов, в которых ГАМК, возможно, является медиатором. С другой стороны, сам медиатор или специфичный агонист или антагонист рецепторов, содержащий радиоактивную метку, может быть использован для обнаружения рецепторов. Другие методы основаны на механизмах инактивации медиаторов. Например, клетки, которые высвобождают биогенные амины или ГAMK, имеют специфичные системы обратного захвата этих медиаторов . Поэтому при инкубации ткани с радиоактивным норадреналином, дофамином, 5-НТ или ГАМК можно избирательно выделить те нервные терминали, которые высвобождают эти медиаторы.
Быстрое нарастание сведений о генах, кодирующих рецепторы нейромедиаторов, сделало возможным разработку и внедрение экспериментальных стратегий, использующих молекулярно-генетические методы. In situ гибридизация позволяет установить местонахождение мРНК. ПЦР, осуществляемая обратной транскриптазой (RT-PCR , reverse-transcritase polimerase chain reaction), делает возможной амплификацию продуктов идентифицированных генов. Эта реакция может быть проведена на небольших фрагментах нервной ткани или даже на единичных изолированных клетках. Можно также вывести трансгенных животных, у которых необходимый ген, предположительно кодируюшии рецептор, удаляют технологией нокаута (gene "knock out") или изменяют каким-либо другим способом. Последующее изучение поведения и физиологии таких животных дает информацию о вкладе гена-кандидата в работу синапсов.
Эксперименты подобного типа могут быть выполнены и на клетках при введении в них антисенс-олигонуклеотидов в условиях in vitro. Наконец, мутации генов, связанных с функциями нейромедиаторов, и имеющие место в естественных условиях у людей или животных, приводят к изменениям поведения , которые позволяют сделать выводы о функциях продуктов, кодируемых этими генами. В случае рецептора для нейромедиатора это могут быть анатомические или функциональные изменения в отделах мозга или даже в отдельных нейронах, чувствительных к этому нейромедиатору.
