Наблюдения за экзэцитозом и эндоцитозом в живых клетках
Аналогичные эксперименты были проведены с использованием высокофлуоресцентных меток для маркировки рециклированных везикул. Внедренная Бетцом и коллегами, эта методика дает то важное преимущество, что кругооборот везикул можно наблюдать в живом препарате по вызываваемым стимуляцией накоплению и высвобождению метки ( рис. 11.23 ). Эти исследования позволили обнаружить, что в нормальных физиологических условиях полный цикл экзоцитоза обратного захвата и формирования новых сннаптических везикул занимает менее 1 минуты. Восстановление же после более интенсивной стимуляции происходит медленнее. Более того, было показано, что захват флуоресцентных меток в пресинаптические бутоны культивируемых нейронов гиппокампа происходит квантовым образом, причем размер каждого кванта соответствует захвату одной синаптической везикулы. Такого рода квантовый захват происходит в течение секунд после начала стимуляции, предполагая, что одиночные события экзоцитоза и эндоцитоза очень близко связаны. Эта методика позволяет анализировать квантовое высвобождение из отдельных пресинаптических бутонов без регистрации постсинаптических ответов. Поскольку регистрирующие электроды не нужны, такие оптические методы оказываются весьма удобными при исследовании пресинаптической функции и долговременной пластичности.
Многообещающим подходом для исследований экзоцитоза везикул является использование не нейрональных секреторных клеток, например, клеток молочной железы и хромаффинных клеток, в которых экзоцитоз больших и плотных секреторных гранул может быть исследован одновременно с помощью световой микроскопии, электрофизиологической регистрации и амперометрии , которая позволяет детектировать амины , выделяемые этими клетками. Слияние одиночных гранул с плазматической мембраной может быть зарегистрировано пэтч-электродом в виде увеличения электрической емкости клетки , которое возникает при добавлении мембранных гранул к клеточной поверхности; обратный же захват мембраны при эндоцитозе приводит к уменьшению емкости ( рис 11.24 ). Алмерс с соавторами в экспериментах на хромаффинных клетках добавили электрод из угольного волокна внутрь пэтч-электрода , чтобы измерить высвобождение катехоламинов , содержащихся в гранулах. Высвобождение обычно детектировалось одновременно с увеличением емкости, как это можно было бы предположить в случае экзоцитоза и включения гранулярной мембраны в плазматическую ( рис. 11.25 ). Однако примерно 15% событий высвобождения сопровождались кратковременным и неполным увеличением емкости. В зтих случаях экзоцитоз, по всей видимости, происходил через маленькое открываемое на короткое время отверстие (fusion pore) , которое затем быстро закрывалось, позволяя грануле отойти обратно в цитоплазму без включения ее в наружную мембрану ( рис. 11.25 D). Такие события типа "поцеловал и убежал" (kiss and run) могут позволить освобождаться маленьким молекулам, например, катехоламинам , чей запас может быть быстро восстановлен, но задерживать при этом большие белки, потеря которых может быть восполнена только синтезом абсолютно новых гранул в аппарате Гольджи .
Изменения емкости, связанные с высвобождением множественных квантов, были измерены в одиночных нервных окончаниях, выделенных из ЦНС позвоночных. Пока еще технически невозможно регистрировать изменения емкости, связанные со слиянием одиночных синаптических везикул. Хотя полное слияние синаптических везикул с пресинаптической мембраной явно происходит во время интенсивной стимуляции, остается неясным, может ли происходить в нормальных физиологических условиях высвобождение по механизму "поцеловатъ и убежать".
