Пэтч-кламп метод измерения мембранного потенциала клетки

Часто используется прием измерения мембранного потенциала, известный как пэтч-кламп целой клетки. Стеклянная пипетка со сравнительно большим полированным кончиком придвигается к поверхности клетки, где она прилипает к мембране и образует прочное соединение. После нарушения целостности мембраны внутри пипетки жидкость в пипетке прямо контактирует с внутриклеточной жидкостью.

Для измерения ионных токов через одиночные каналы первоначально был предложен непрямой метод анализа мембранного шума . Затем был разработан способ прямой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода пэтч-кламп (patch-clamp). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, касающиеся функции ионных каналов, как то:

- какой заряд проходит через одиночный канал?

- как долго канал остается открытым?

- как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембранного потенциала ?

Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Неером, Б. Сакмангом и их коллегами, значительно углубил наши знания о функционировании ионных каналов. Для пэтч-кламп регистрации необходимо, чтобы кончик стеклянной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведении, благодаря легкому присасыванию, между клеточной мембранои и стеклом пипетки ( рис. 2.З А-В) создается сопротивление больше 10 в 9-ой степени ом (отсюда возник термин " гигаомный контакт", gipaohm seal ). Когда пипетка соединена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходящие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки ( рис. 2.3 F). Такая конфигурация пэтч-кламп метода называется cell attached (контакт с клеткой) . Высокоомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через усилительную аппаратуру, а не теряются в месте контакта пэтч-пипетки с клеткой. При использовании пэтч-кламп метода регистрируемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы открытия и закрытия одиночных ионных каналов. Таким образом, мы в реальном времени можем наблюдать активность одиночных белковых молекул мембраны.

В простом случае токи одиночных каналов появляются нерегулярно и с различной продолжительностью, но с постоянной амплитудой ( рис. 2.4 А). В некоторых случаях, однако, картина токов может быть более сложной. Некоторые ионные каналы, например, в открытом состоянии могут иметь более чем один уровень проводимости, как это показано на рис 2.4 В. Кроме того, ионные каналы могут проявлять комплексную кинетику. Например, ток через одиночным ионный канал может выглядеть не как простой прямоугольник, а как "вспышка" открытий канала ( рис.2.4 С).

Таким образом, пэтч-кламп метод предоставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мембраны позволяет наблюдать активность всего нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта дает возможность регистрировать даже крайне малые токи. В результате мы имеем возможность точного измерения амплитуд токов одиночных ионных ианалов и можем провести анализ кинетики каналов.

Ссылки: