Экспериментальные доказательства электрогенности ионного насоса
В результате того, что насос переносит за один цикл неодинаковое количество ионов натрия и калия , происходит суммарный перенос через мембрану одного положительного заряда. Поэтому насос называется электрогенным. Это свойство насоса было протестировано экспериментально на аксоне кальмара , а также Томасом на нейронах улитки . Нейроны улитки достаточно велики для того, чтобы можно было ввести несколько микроэлектродов в цитоплазму, не повреждая клетки. Для исследования взаимосвязи между внутриклеточной концентрацией натрия, током через насос и мембранным потенциалом Томас использовал две микропипетки для введения ионов в клетку, одна из которых была заполнена ацетатом натрия , а другая ацетатом лития ( рис. 4.1 А). Третья пипетка использовалась в качестве электрода для регистрации мембранного потенциала . Четвертая пипетка служила токовым электродом, обеспечивающим режим фиксации потенциала (voltage-clamp; глава 6 ). Еще один электрод, сделанный из натрий-чувствительного стекла, позволял измерять внутриклеточную концентрацию натрия. Для инъекции натрия на электрод, заполненный ионами натрия, подавалось положительное напряжение по отношению к электроду, содержащему ионы лития. Таким образом, весь ток в инъекционной системе протекал между двумя пипетками внутри клетки, а не через клеточную мембрану.
Результат опыта показан на рис. 4.1 В. После кратковременной инъекции работа насоса активизировалась и мембрана клетки гиперполяризовалась приблизительно на 20 мВ. По мере того, как избыточное количество натрия выводилось из клетки, мембранный потенциал постепенно восстанавливался, что занимало несколько минут. Инъекция лития, произведенная посредством приложения положительного потенциала к литиевой пипетке, не привела к гиперполяризации клетки.
Можно выделить несколько фактов, подтверждающих участие насоса в изменении мембранного потенциала, Так, в присутствии блокатора транспорта ( уабаина ) гиперполяризация мембраны была значительно менее выраженной или полностью устранялась ( рис. 4.1 С). Кроме того, устранение калия из внеклеточного раствора приводило к исчезновению влияния инъекции натрия на мембранный потенциал; восстановление уровня внеклеточного калия после инъекции натрия вызывало немедленную гиперполяризацию ( рис.4 .ID).
Количественные оценки скорости работы насоса и соотношения обмениваемых ионов были получены в опытах с фиксацией потенциала. Этот метод (описанный в главе 6 ) позволяет измерять ток, протекающий через мембрану, в то время как мембранный потенциал поддерживается на неизменном уровне. Концентрация натрия также измерялась в ходе этого опыта. Инъекция натрия вызвала кратковременное повышение его внутриклеточной концентрации, которое сопровождалось выходящим током. Длительность и амплитуда этого выходящего тока зависели от изменения концентрации натрия внутри клетки ( рис. 4.1 Е). Величина суммарного заряда, перенесенного наружу клетки, была подсчитана на основании измерения интеграла мембранного тока (то есть площади под кривой тока). Суммарный заряд составил приблизительно одну треть заряда ионов натрия, инъецированных в клетку. Эти данные подтверждают представление о том, что на каждые три иона натрия , выводимого насосом из клетки, приходится два иона калия , переносимые внутрь.
