Ген bcl-2: изменения при лимфомах
Реципроктная транслокация t(14;18) обнаруживается в большинстве лимфом с фолликулярной морфологией и в одной трети диффузных крупноклеточных лимфом ( Tsujimoto et al., 1984 ; Cleary, Sklar, 1985 ; Tsujimoto, Croce, 1986 ; Yunis et al., 1987 ; Weiss et al., 1987 ). Частота такой транслокации зависит, по-видимому, от региона ( Amakawa et al., 1989 ; Pezzella et al., 1990 ). Так, при фолликулярной лимфоме эта транслокация чаще всего обнаруживается в США (90%), с промежуточной частотой встречается в Европе (70%) и лишь изредка в Японии (30%) ( Amakawa et al., 1989 ).
Как показали молекулярно-генетические исследования, при транслокации t(14;18) обычно осуществляется перенос гена bcl-2 ( B cell lymphoma/leukemia-2 ), расположенного на хромосоме 18, в транскрипционно активный иммуноглобулиновый локус, расположенный в бенде 14q32 (ген IgH ) ( Cleary et al., 1986 ; Seto et al., 1988 ; Tsujimoto et al., 1988 ). При этом происходит дерегуляция гена bcl-2 , являющегося окоген ом ( Reed et al., 1988 ).
В 70% случаев при t(14;18) разрыв происходит в небольшой (около 100 пар нуклеотидов) 3'-нетранслируемой области экзона 3 гена bcl-2 ( mbr - major breakpoint region), расположенной в 18q21 ( Tsujimoto et al., 1985 , Tsujimoto et al., 1987 ; Tsujimoto, Croce, 1986 ; Cleary, Sklar, 1985 ). Точки разрыва в локусе IgH расположены обычно точно на 5'конце сегментов JH ( Bakhshi et al., 1985 ).
Анализ первичной структуры 3'-горячей точки гена bcl-2 , по которой происходит разрыв при транслокации, позволил обнаружить в ней сигнальные последовательности, участвующие в процессе рекомбинации генов Ig . Все это позволило сделать вывод о прямом участии V-(D)-J-рекомбиназы в транслокации хромосом t(14;18) . Эта рекомбиназа, в частности, осуществляет разрыв на хромосоме 14.
Менее понятен механизм разрыва хромосомы 18. Недавно получены указания на участие в этом процессе эндогенной нуклеазной активности, присутствующей в ранних В-клетках ( Jaeger et al., 1991 ). Эти авторы выделили из ядерных экстрактов В-клеток белок с мол. массой 45 кД, который избирательно связывался с гомопурин-гомопиримидиновой последовательностью гена bcl-2 , расположенной на 5'-границе mbr .
Поскольку перемещение гена bcl-2 осуществляется именно в локус IgH есть основания думать, что этот процесс происходит на стадии пре-В-клеток.
Имеется между тем и иная точка зрения. Были, в частности, получены данные, говорящие о том, что разрыв на хромосоме 18 не происходит в месте сигналов для рекомбиназы ( Bakhshi et al., 1987 ). Авторы обнаружили не полностью реципрокный характер транслокации t(14;18) . При этой транслокации часто происходит делеция области, расположенной между сегментами DH и JH, а также появляются экстрануклеотиды в местах соединения der(14) и der(18). Все это предполагает, что незаконное спаривание осуществляется между концами сегментов DH;and JH на хромосоме 14 и двунитевыми разрывами на хромосоме 18 ( Tsujimoto et al., 1988 ). Согласно данным Кнеба с соавт. ( Kneba et al., 1991 ), полученным при анализе 165 NHL с t(14;18) , при которой формируется слитая последовательность bcl-2 /JH за счет разрыва в mbr , встречается только в трех подгруппах лимфом: центробластно-центроцитарных (39%), центробластных (6%) и иммуноцитарных (8%).
Слитая последовательность формирует ген ( bcl-2 - IgH ), который экспрессируется конститутивно с образованием различных химерных транскриптов ( Cleary, Sklar, 1985 ), кодирующих белок Bcl-2 , неотличающийся от белка, синтезируемого на неперестроенном гене bcl-2 . Вместе с тем показано, что в ряде случаев транслоцированный ген bcl-2 содержит, подобно гену c-myc в клетках BL , соматические мутации, которые вызывают изменения в кодирующей области ( Seto et al., 1988 ; Tanaka et al., 1992 ). Поскольку при фолликулярной лимфоме происходит гипермутация в локусе IgH ( Cleary et al., 1986 ), которая в норме осуществляется на очень специфичной стадии развития В-клеток, имеются основания считать, что в отличие от BL (см. выше) при фолликулярной лимфоме В-клетки проходят эту стадию.
Вместе с тем анализ, проведенный Хуа с соавт. ( Hua et al., 1990 ), не позволил выявить соматические мутации в гене bcl-2 ни в одной из 12 проанализированных фолликулярных лимфом. Эти авторы считают, что нарушение роста и дифференцировки при данных В-клеточных лимфомах обусловлено скорее всего аномальной экспрессией гена bcl-2 , а не его структурными изменениями.
В связи с противоречивостью данных относительно соматических мутаций, изменяющих Bcl-2 при фолликулярных лимфомах, возник вопрос, не являются ли они результатом применения хемотерапии к пациентам. Исследуя больных с транслокацией t(14;18) , которые не подвергались лечению от этого заболевания, Танака с соавт. ( Tanaka et al., 1992 ) обнаружили 6 точечных мутаций в кодирующей области гена bcl-2 в 3 из 5 опухолей, причем у 2 пациентов была выявлена идентичная транзиция C - T. Наличие такой транзиции, характерной для Ig-генов и транслоцируемого гена c-myc ( Zajac-Kaye et al., 1988 ; Morse et al., 1989 ), а также выявление кластера из 4 точечных мутаций в транслоцируемом гене bcl-2 у одного из пациентов, позволил авторам сделать вывод о действии соматического гипермутационного механизма, ассоциированного с Ig-генами . Поскольку в данном случае ген bcl-2 располагался на расстоянии примерно 300 кб от локуса IgH , этот механизм может работать на большой дистанции от Ig-генa . Между тем вопрос о роли соматических мутаций в прогрессии лимфом остается открытым.
Известно, что транслоцированный ген bcl-2 активно экспрессируется в фолликулярных лимфомах, а неизмененная аллель является транскрипционно молчащей ( Seto et al., 1988 ). Причина транскрипционной дерегуляции транслоцированного гена bcl-2 пока остается не до конца ясной. Поскольку энхансер гена IgH при транслокации оказывается рядом с геном bcl-2 , было постулировано, что подстановка гена bcl-2 в цис-положение по отношению к этому потенциальному энхансеру и вызывает дерегуляцию гена. Как показало исследование, проведенное Ридом с соавт. ( Reed et al., 1989 ), экспрессия гена bcl-2 в клетках с t(14;18) изменяется на уровне транскрипции. В отличие от нормальных лимфоцитов, в лимфомных клетках транскрипция происходит постоянно на высоком уровне.
Неопределенность, в частности, связана с тем, что иногда точки разрыва при фолликулярной лимфоме располагаются в других местах гена bcl-2 , например, в 10-20% случаев они локализуются 3' по отношению к гену в так называемой области mcr (minor cluster region), которая лежит на расстоянии около 30 кб от гена ( Cleary et al., 1987 ). Изредка разрывы обнаруживают и на 5'-конце гена bcl-2 . Такая "горячая точка" транслокации характерна, например, для фолликулярной лимфомы, в которой обнаружен необычный порядок расположения рекомбинирующих генов ( Tsujimoto et al., 1987 ). В данном случае при транслокации произошла, по-видимому, инверсия или bcl-2 , или локуса IgH .
Хиллион с соавт. ( Hillion et al., 1991 ) обнаружили три фолликулярных лимфомы с вариантной транслокацией t(2;18)(p11;q21) , при которой разрыв в гене bcl-2 произошел на 5'-конце, а переместился он в локус IgK . Это напоминает ситуацию, имеющую место при вариантной транслокации в случае BL, когда идет перемещение локуса c-myc в локус IgL . Поскольку во всех 3 описанных Хиллионом с соавт. лимфомах разрыв происходил в одной и той же 5'-области гена bcl-2 , можно говорить о наличии еще одного "горячего" кластера. Как показал специально проведенный анализ ( Adachi, Tsujimoto, 1990 ), в 5'-горячей точке гена bcl-2 содержатся элементы, потенциально способные принимать Z-форму, а сигнальные последовательности, обнаруженные в 3'-горячей точке, отсутствуют.
Таким образом, транслокации гена bcl-2 могут осуществляться с помощью различных молекулярных механизмов. Вероятно перестройкам, происходящим между bcl-2 и IgH , способствует открытая конформация этих генов, экспрессирующихся в пре-В-клетках. Рекомбинация же bcl-2 и IgL происходит, когда bcl-2 уже не экспрессируется, но при этом, возможно, в открытой конформации остается 5'-концевой домен гена.
В результате транслокации хромосом при лимфомах ген bcl-2 экспрессируется в В-клетках постоянно ( Seto et al., 1988 ). Предполагается, что белок Bcl-2 в норме может участвовать в фолликулярной организации лимфоцитов, а нарушения в локусе bcl-2 могут приводить к развитию слабых (indolent) лимфом, дифференцировка которых напоминает архитектуту нормальных лимфоузлов ( Koduru, Offit, 1991 ).
При фолликулярной лимфоме в результате хромосомной транслокации часто образуется новая генная структура, обеспечивающая транскрипцию гибридной мРНК : bcl-2 / IgH (конкретно bcl-2 /JH или bcl-2 /DH). При этом может осуществляться соединение гена bcl-2 с Сgammma-областью IgH -гена. Гамма-локус Ig-ген а является гипермутабельным и, как оказалось, транслоцированный в этот локус ген bcl-2 содержит соматические мутации ( Seto et al., 1988 ). Позднее, однако, Хуа с соавт., исследуя возможные механизмы возникновения фолликулярной лимфомы, обнаружили ( Hua et al., 1990 ), что во многих случаях имеет место не образование гибридного продукта, а лишь усиление экспрессии гена bcl-2 . При этом выяснилось, что мутации в кодонах 7 или 129, которые были известны ранее ( Seto et al., 1988 ), не обязательны при возникновении лимфомы, хотя и являются доволно частым со- бытием ( Tanaka et al., 1992 ).
Белок Bcl-2 , кодируемый геном bcl-2 , относится к классу G-белков ( Haldar et al., 1989 ). В норме этот белок, частично ассоциирован с клеточной мембраной, а также обнаруживается в перинуклеарном эндо- плазматическом ретикулуме ( Tsujimoto, Croce, 1988 ; Chen-Levy et al., 1989 ). Он экспрессируется в пре-В-клетках, но отсутствует в терми- нально дифференцированных В-клетках. Считается, что Bcl-2 блокирует программированную клеточную смерть в В-клетках и поддерживает способ- ность к иммунному ответу ( Nunez et al., 1991 ). Интересно также, что белок Bcl-2 , обладает гомологией с одним из белков EBV ( Cleary et al., 1986 ). Показана комплементация продуктов генов bcl-2 и c-Ha-ras , которые имеют сходную локализацию и сходные биохимические свойства ( Reed et al., 1990b ). Котрансфекция этих белков в фибробла- сты грызунов приводила к морфологической трансформации клеток.
Котрансфекция Bcl-2 с ядерными онкобелками (например, c-Myc ) не вызывала подобный эффект. В то же время продукты онкогенов c-myc и c-Ha-ras комплементируют друг с другом. Следовательно, сходные онкобелки ( Bcl-2 и c-Ha-Ras ) регулируют, по-видимому, различные комплементарные пути, приводящие к клеточной трансформации.
Анализ двух линий лимфомных клеток из японских больных, проведенный Амакава с соавт. ( Amakawa et al., 1990 ), показал, что при фолликулярной лимфоме наряду с транслокацией хромосом имеет место амплификация хромосомы 18q-, которая происходит в результате дупликации.
