B-Клеточная лимфома: изменения других хромосомных локусов
При В-клеточных лимфомах t(11;14) может затрагивать не только локус bcl-1 , но и другие участки. Акао с соавт. ( Akao et al., 1991 ) описали B-cell lymphoma line, в которой имела место транслокация t(11;14)(q23;q32) . В этом случае разрывы произошли между константными областями IgH-гена Спсевдо-гамма и Сгамма2 на хромосоме 14q32 и между генами CD3 и ETS-1 на хромосоме 11q23. Фрагмент хромосомы 11, внедренный в хромосому 14, обозначен авторами как локус rck . Хотя известны и другие случаи транслокаций бенда q23(11q23), ни в одном из них локус rck не был затронут ( Akao et al., 1991 ).
Крупноклеточная анапластическая Ki-1-позитивная лимфома обычно ассоциирована с t(2;5) ( Le Beau et al., 1989 ). Вместе с тем известен случай и с транслокацией t(9;14)(p13;q32) . При этом разрыв хромосомы 14 произошел на расстоянии 265 п.н. за фрагментом JH6 IgH. Описан пациент с Ki-1 лимфомой, у которого обнаружена сильная экспрессия G-CSF ( Nishihira et al., 1991 ).
В некоторых случаях при NHL обнаруживают хромосомные делеции. Так, иногда имеет место делеция в хромосоме 9. В результате такой делеции происходит потеря бета-интерферонового гена ( Diaz et al., 1988 ). Предполагается, что или сами интерфероновые гены могут выступать как доминантные гены-супрессоры опухолей, или такие супрессорные гены расположены рядом с интерфероновыми генами человека.
Считается, что гены семейства ras не имеют отношения к возникновению лимфом, поскольку при анализе 68 В-клеточных NHL не удалось обнаружить мутаций, которые обычно активируют данные онкогены в других типах лимфоидных и нелимфоидных опухолей ( Neri et al., 1988b ). Гартер с соавт. ( Garter et al., 1990 ) выявили отдельные мутации только после цитотоксической терапии NHL . Из 70 пациентов с NHL после излечения с помощью химеотерапии у 2 наблюдались мутации в гене Ha-ras и у 7 в гене N-ras . Вместе с тем, анализ линии лимфомных В-клеток, полученной от больного с иммунобластной лимфомой и содержащей 45 хромосом, показал ( Ho et al., 1990 ), что в них имеет место высокий уровень экспрессии двух онкогенов: c-Ha-ras и c-myc . Инъекция таких клеток бестимусным мышам приводила к развитию асцита, солидных опухолей и метастазов в легких. Точковые мутации в гене Ha-ras обнаружили и Имамура с соавт. ( Imamura et al., 1992 ) при анализе 5 злокачественных лимфом.
В отличие от нодулярной фолликулярной и диффузной лимфом, исследование гастроинтерстициальной экстранодулярной лимфомы показало, что в ней перестроек локусов bcl-1 и bcl-2 практически нет, а как и при LB происходят перестройки гена c-myc , которые в большинстве случаев отличаются от описанных ранее для других лимфом ( van Krieken et al., 1990 ). Аналогичная картина характерна, по-видимому, для всех В-клеточных лимфом MALT ( Wotherspoon et al., 1990 ). Вместе с тем, как уже указывалось выше, хромосомные аномалии в этих лимфомах имеют место и связаны с локусами, расположенными на других хромосомах, в частности на коротком плече хромосомы 1p (бенд 1p22) ( Wotherspoon et al., 1992 ).
Анализ последовательностей в точках разрыва при транслокациях, характерных для В-клеточных не-BL, указывает на то, что перестройки в большинстве случаев происходят на пре-В-стадии во время V-D-J-рекомбинации в иммуноглобулиновых генах ( Tsujimoto et al., 1985 ; Tsujimoto et al., 1988 ). Кроме того, следует отметить, что точки разрыва при транслокациях во многих не-BL лежат в 5'-области по от- ношению к J-фрагменту Ig-генов; в местах соединения хромосом как при t(11;14) , так и при t(14;18) встречаются экстрануклеотиды (N-области) и, наконец, вблизи точек разрыва на хромосомах 11 и 18 присутствуют участки, напоминающие гептамерные и нономерные сигнальные последовательности, которые участвуют в физиологическом процессе соединения сегментов J-D-V ( Croce, 1987 ). Все эти факты с большой вероятностью указывают на вовлечение в процессы транслокаций хромосом V-D-J-рекомбиназы, которая ошибочно связывает J-область гена IgH с онкогенами.
В опухолях с двойными транслокациями выявлены перестройки генов IgH , IgL (kappa and lambda), локуса bcl-2 и c-myc .
Исследование линии клеток с острой В-клеточной лимфобластической анемией, в которой имели место 2 транслокации t(8;14) и t(14;18) , проведенное Гауверки с соавт. (Gauwerky et al., 1988 ), показало, что сначала у пациента, по-видимому, в пре-В-клетках произошла перестройка гена bcl-2 (транслокация t(14;18) ), которая привела к возникновению фолликулярной лимфомы, а затем в результате второй транслокации ( t(8;14) ), затронувшей ген c-myc , лимфома развилась в острую преВ-клеточную лейкемию. При этом первый случай есть результат ошибки при соединении V-D-J, а второй при переключении класса Ig .
Молекулярный анализ 2 транслокаций, выявленных в сложной (composite) лимфоме ( t(14;18) и t(8;14) ), показал, что первая из них произошла на стадии пре-В-клеток, а вторая - во время переключения изотипа IgH в трансформированных клетках ( De Jong et al., 1988 ).
Хромосома 14 участвует также в транслокации t(10;14)(q24;q32) , которая просходит в 7% случаев при low grade B cell NHL и менее часто при intermediate and high grade NBL ( Neri et al., 1991 ). Как показано Нери с соавт., при этом происходит перенос области Calpha1 Ig-гена к гену lyt-10, расположенному на хромосоме 10. Образующийся слитый ген lyt-10 -Calpha1 кодирует белок, который гомологичен фактору транскрипции NF-kB p50 . Этот белок связывается, как и NF-kB, с последовательностью kB и относится к одному из субсемейств транскрипционных факторов, обладая, по-видимому, онкогенным потенциалом.
Как в случае, обнаруженном при совместные транслокации t(8;22) и t(14;18) ( иммунобластическая лимфома), так и в случае совместной транслокации t(8;14) и t(18;22) ( недифференцированная лимфома ) ( Koduru, Offit, 1991 ) первичная транслокация происходила на пре-В- клеточной стадии и приводила к дерегуляции bcl-2 или c-myc . Из проведенного исследования ясно, что вторичная дерегуляция c-myc в лимфомных клетках с дерегулированным геном bcl-2 ведет к быстрой прогрессии high grade заболевания. Кооперативное действие генов bcl-2 и c-myc подтверждается также экспериментами по переносу генов в культуру клеток ( Vaux et al., 1988 ). В 4 описанных случаях лимфом с двойной транслокацией первоначально в результате рекомбинационной ошибки дерегулировался ген bcl-2 на стадии пре-В-клеток, а затем дерегулировался ген c-myc, в результате рекомбинации с S-областью IgH . Известен пример, когда последовательность нарушений была обратной. Следует отметить, что превращение from low-grade в high- grade лимфому ассоциировано со множеством различных изменений в лимфоцитах. В частности, ( Takahashi et al., 1991 ) обнаружили специфические антитела ( Trump ) к трансферриновому рецептору, которые взаимодействуют только с high-grade lymphoma . В данном случае это связано с более открытой ориентацией рецептора трансферрина на поверхности клеток.
Описан случай существования одновременно трех транслокаций между хромосомами 8, 14 и 18 ( t(8;14;18) ) при лимфобластной лимфоме ( Kiem et al., 1990 ). В отличие от тех, о которых шла речь выше и при которых транслокация t(8;14) осуществлялась на аллеле IgH , невовлеченном в транслокацию t(14;18) (это приводило к одновременной экспрессии генов c-myc и bcl-2 в злокачественных клетках), Кием с соавт. обнаружили три пути транслокаций между 3 хромосомами. При этом происходило соединение JH-области гена IgH с областью mcr гена bcl-2 , а кроссинговер между хромосомами 8 и 18 осуществлялся на 3'-конце гена bcl-2 , приводя к замене этого гена на хромосому 14q+ с геном c-myc . В результате такой перестройки ген bcl-2 инактивировался, а ген c-myc конкурентно активировался. Транслокация t(8;14;18) аналогична транслокации t(8;14) при BL , т.к. в обоих случаях разрыв на хромосоме 8 осуществляется в 5'-области гена c-myc и транслоцированная аллель обеспечивает синтез полноразмерного транскрипта, неотличимого от нормы. Однако в отличие от BL , при которой патогенный эффект транслокации связывают с дерегуляцией экспрессии гена c-myc , не определено, был ли этот случай вовлечения аллеля c-myc в транслокацию t(8;14;18) .
Сообщалось об обнаружении трех различных стадиеспецифических трансформирующих генах, активных в линии В-лимфоцитов ( Lane et al., 1982 ). Предполагается, что некоторые из них (в частности, Blym-1 ) имеют непосредственное отношение к возникновению лимфом, однако, прямо это пока не продемонстрировано; остается неясным и механизм активации этих генов.
Некоторые данные, относительно различных транслокаций, стадий, на которых они происходят, и типов возникающих у человека лимфом, суммированы в работе ( Koduru, Offit, 1991 ).
Этим, однако, не ограничиваются изменения, которые удалось к настоящему времени выявить при различных формах В-клеточных лимфом. В частности, в некоторых случаях при NHL у человека имеет место инсерция на хромосоме 2, ins(2;2) (p13;p11.2-14) ( Lu et al., 1991 ). Молекулярным следствием этой инсерции является слияние двух генов в манере сходной с транслакационным слиянием. В результате этого образуется слитый белок REL-NRG , сохраняющий N-концевой ДНК-связывающий и активирующий транскрипцию домены REL , а C-конец замещается последовательностью NRG с неизвестной функцией. Как выяснилось, протоонкоген c-rel и индуцируемый клеточный фактор HIVEN86A являются одним и тем же белком ( Lee et al., 1991 ). Поскольку ранее было известно, что HIVEN86A специфически связывается с энхансером kB , расположенным в LTR HIV , и усиливает транскрипцию вирусного генома, имеются основания думать, что возникновение лимфом при инфицировании HIV может быть связано с индукцией гена c-rel . Это косвенно подтверждается также данными о том, что наибольший уровень экспрессии онкогена c-rel характерен для В-клеточных лимфом мышей ( Grumout, Gerondakis, 1990 ). Кроме того, вирус Rev-T , вызывающий у инфицированных цыплят множественные лимфомы, содержит ген v-rel - гомолог гена c-rel ( Gilmore, 1991 ).
Отмечалось еще сильная экспрессия онкогена lck в В-клеточных лимфомах, а также при Т-клеточных лейкемиях ( Veillette et al., 1987 ; Adler et al., 1988 ), но было обнаружено, что этот онкоген может эффективно экспрессироваться и в других злокачественных линиях клеток человека ( Sartor et al., 1989 ). Хотя пока еще трудно сделать однозначный вывод о роли гена lck в возникновении В-клеточных лимфом, накапливающиеся постепенно данные свидетельствуют в пользу его участия в Т-клеточном лимфомогенезе (см. далее).
Интересные результаты получены Саппино с соавт. ( Sappino et al., 1990 ). При анализе 35 NHL выяснилось, что в 12 из них содержится высокий уровень мРНК фактора некроза опухолей ( TNF ), а в 19 - мРНК лимфотоксина. Полученные результаты указывают то, что лимфомы со сходными гистологическими характеристиками весьма гетерогенны в отношении синтеза цитокинов - веществ, потенциально влияющих на рост опухолевых клеток. Томода с соавт. ( Tomoda et al., 1991 ) обнаружили повышенный уровень экспрессии в злокачественных лимфомах гена poly(ADP-ribose)synthetase , что объясняется, по-видимому, дедифференцировкой клеток.
Выше уже говорилось о вирусной этиологии некоторых лимфом человека. Пока мало что известно о механизмах, с помощью которых вирусы вызывают злокачественные перерождения лимфоидных клеток. Отмечалось, например, что в про-В клетках, трансформированных EBV , имеет место рекомбинация между Sмю-областью Ig-гена, расположенной на хромосоме 14, и различными другими хромосомами, которая происходит при размножении этих клеток in vitro ( Altiok et al., 1989 ). Это указывает на широкие возможности транслокаций между хромосомой 14 и другими хромосомами на про-В стадии. Вероятно, только те транслокации, которые дают селективные преимущества, детектируются в конечном итоге. В данной работе авторы не обнаружили участие гена c-myc в транслокации. Однако, как полагают исследователи, условия in vivo и in vitro могут значительно отличаться и in vivo такие преимущества дает транслокация гена c-myc .
Интересное наблюдение сделано Берберианом с соавт. ( Berberian et al., 1991 ) при анализе пациентов, инфицированных HIV . В результате анализа VH-генов у таких больных удалось показать задержку созревания B-клеток. Следовательно, под действие HIV может происходить задержка дифференцировки B-клеток, что наблюдается при многих формах лимфом.
У обезьян также обнаружено несколько типов спонтанных лимфом. Возникающие в природных условиях опухоли включают такие как иммунобластическая саркома и недифференцированная лимфома. Хант с соавт. ( Hunt et al., 1983 ) описали случаи, когда у макак имела место NHL типа диффузной гистоцитарной и retroorbital лимфомы. Эти 2 спонтанные лимфомы, возникшие у обезьян M. mulatta, трансмиссировались здоровым животным и приводили к возникновению недифференцированных лимфом. На основании гематологического анализа авторы сделали вывод о тесной взаимосвязи лимфом со СПИДом. Вместе с тем, очевидно, что СПИД и инфицирование вирусами иммунодефицита не всегда вызывают появление лимфомы. Так, при заражении M. mulatta SIVmac239 у обезьян возникал грануломатозный энцефаломиелит и ряд других заболеваний, но у них не обнаруживали лимфомы ( Kestler et al., 1990 ). В то же время при заражении этим же вирусом макак резус ( Kestler et al., 1991 ) все эти животные имели лимфатические узлы с различными стадиями фолликулярной гиперплазии, т.е. имели картину, ассоциированную с сильной лимфоаденопатией.
Этиологическим агентом В-клеточных лимфом у мышей является мышиный вирус лейкемии Абельсона ( Abelson murine leukemia virus , A-MuLV ) ( Premkumar et al., 1975). Этот дефектный по репликации трансформирующий ретровирус был изолирован из лимфом, индуцированных инокуляцией Mo-MuLV в обработанных преднизолоном мышей линии. В качестве трансформирующего агента у A-MuLV выступает ген v-abl ( Srinivasan et al., 1982 ). В частности было показано, что В-клеточные лимфомы (plasmacytoid lymphosarcomas) у мышей, индуцируемые A-MuLV , возникают в результате действия онкогена v-abl и инсерции вируса вблизи клеточного онкогена myb ( Ramakrishan, Rosenberg, 1989 ; Kelliher et al., 1990 ). Основной кодируемый A-MuLV белок ( Abelson protein ) обладает протеинкиназной активностью. Ген v-abl кодирует С-конецевой участок этого белка. Как показало более детально проведенное исследование ( Parmar et al., 1991 ), для индукции лимфомы необходимы по крайней мере 452 аминокислот v-abl-кодируемой части Abelson protein .
При изучении ДНК из 14 пре-В и В-клеточных лимфом 6 инбредных линий мышей Муценски с соавт. ( Mucenski et al., 1988 ) обнаружили, что из 8 онкогенных локусов ( myc, pim-1, pvt-1, Mlvi-1 (эквивалент pvt-1 ), evi-1, Mlvi-2, fis-1 и myb ), которые они проанализировали, перестройки наблюдаются только в 4 ( evi-1 , myc , Mlvi-1 и pvt-1 ).
У мышей под действием гена v-abl и гибридного гена bcr/abl, экспрессирующихся в трансформированном in vitro и пересаженом костном мозге, в 50% образовывались пре-В-клеточные лимфомы ( Kelliher et al., 1990 ). Трансформацию in vitro лимфоидных клеток под влиянием пары генов bcr/abl и src , но не гена myc совместно с ras наблюдали Енгельман и Розенберг ( Engelman, Rosenberg, 1990 ). Эти авторы отмечают, что метаболические пути, приводящие к злокачественному перерождению, различны для первой и для второй пары онкогенов. Полученные результаты соответствуют ранее описанным данным, согласно которым ген ras не играет существенной роли при возникновении В-клеточных лимфом (см. выше).
В-клеточные лимфомы у мышей могут возникать и под действием онкогена v-fms из вируса FeSV . Клеточный аналог этого гена c-fms представляет собой онкоген со свойствами рецептора M-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор). Хотя в природе опухоли, вызываемые вирусом FeSV, представляют собой фибросаркомы, у мышей с перенесенным в них костным мозгом, который был за счет инфекции трансформирован геном v-fms , развиваются опухоли многих гемопоетических линий клеток включая и В-клеточные лимфомы ( Heard et al., 1987 ).
В некоторых случаях при агрессивной В-клеточной лимфоме у мышей обнаружили прекращение экспрессии гена myb ( Sopchak et al., 1991 ). При анализе структуры 7 различных онкогенов ( abl , myc , Ha-ras , Ki-ras , raf и myb ) в 8 таких лимфомах удалось выявить единственное изменение - делецию одного аллеля гена c-myb .
