Ген фенилаланингидроксилазы: мутации и фенилкетонурия
В 1986 году впервые удалось локализовать точечную мутацию в гене фенилаланингидроксилазы (ФАГ) человека, обусловливающую классическую форму фенилкетонурии ( DiLella A.G.,1986 ). До 90-х годов исследование мутаций генов человека было чрезвычайно трудоемкой и длительной процедурой. Для выявления мутаций необходимо было на основе ДНК больного создать геномную или кДНК библиотеку, далее с помощью гибридизации выявить рекомбинантные клоны, содержащие нуклеотидные последовательности исследуемого гена и затем определить первичную структуру (нуклеотидную последовательность) клонированного фрагмента ДНК. С помощью вышеперечисленных методов была определена первая точечная мутация в гене ФАГ у больного фенилкетонурией из датской популяции, представлявшего собой гомозиготу по 3 гаплотипу - HP3 ( DiLella A.G.,1986 ). Сиквенс-анализ позволил выявить транзицию G-A, локализованную в каноническом динуклеотиде (GT) донорного участка сплайсинга 12 интрона. Как показали дальнейшие исследования, описываемая сплайсинговая мутация (IVS-12) обусловливает делецию 116 нуклеотидов в мРНК, т.е. ведет к срезанию 12 экзона ( Marvit J.,1987 ). Синтезируемый фермент фенилаланингидроксилазы, кодируемый таким мутантным аллелем, утрачивает 52 терминальных аминокислотных остатка с карбоксильного конца цепи, что приводит к нестабильности белка и потери ферментативной активности.
В следующем 1987 году была идентифицирована вторая точечная мутация в гене ФАГ у больного с классической формой фенилкетонурии также из датской популяции ( DiLella A.G.,1987 ). Сиквенс-анализ позволил определить точечную мутацию, представляющую собой транзицию C-Т, локализованную в первом положении 408 кодона, расположенного в 12 экзоне. Ранее было установлено, что больной является гомозиготой по 2 гаплотипу - HP2. Такая нуклеотидная замена ведет к мутационной замене аминокислот (аргинин - триптофан) в 408 положении пептида, что обусловливает потерю ферментативной активности.
Методическим подходом, коренным образом изменившим молекулярный анализ повреждений гена, был, разработанный в 1985 году Карлом Мюлесом, метод полимеразной цепной реакции (PCR или ПЦР). Эта методика произвела революционный переворот в решении многих экспериментальных задач в различных областях биологии и медицины, в том числе в медицинской генетике. Если в 1986-1988 годах в гене фенилаланингидроксилазы человека выявлялось всего лишь по одной мутации в год, то начиная с 1989 года число выявленных новых мутаций в гене ФАГ человека резко возросло. Так в 1989 году было зарегистрировано 6 новых мутаций, в 1990 году - 8 новых мутаций, а в период с 1991 по 1994 годы число вновь выявляемых мутаций в гене ФАГ человека за один год достигало 25-30.
В настоящее время Консорциумом по анализу гена ФАГ в апреле 1995 года в гене фенилаланингидроксилазы человека зарегистрировано свыше 170 мутаций ( Scriver C.R.,1995 ).
В Таблице 4 представлены идентифицированные к настоящему времени точечные мутации, выявленные в гене фенилаланингидроксилазы человека. Молекулярные повреждения гена ФАГ удобно разбить на следующие группы:
1) мутации в промоторе;
2) мутации, затрагивающие инициирующий кодон;
3) missense мутации;
4) nonsense (терминирующие) мутации;
5) silent (нейтральные или молчащие) мутации;
6) сплайсинговые мутации;
7) делеционнные мутации.
В Консорциум включен ряд мутаций, которые не опубликованы в печати, и вероятно требуют дополнительных подтверждений.
Согласно зарегистрированным мутациям гена ФАГ в различных странах наблюдается следующая картина распределения генетических повреждений в гене ФАГ по различным регионам Земного Шара.
Так как первые точечные мутации в гене ФАГ у больных фенилкетонурией были описаны в датской популяции, то наиболее изученной в настоящее время является популяция больных ФКУ этой страны. Проводимые исследования в период 1986-1995 годов выявили в датской популяции 35 мутаций, в том числе 23 missense мутации, 4 nonsense мутации, 5 сплайсинговых мутаций и 3 делеции ( Guldberg P.,1993b ; Guldberg P.,1994 ).
В соседних с Данией странах - Швеции и Норвегии - были выявлены мутации в 272 и 364 кодонах ( Apold J.,1990 ; Svensson E.,1990 ). На южном побережье Норвегии, а также в Швеции в 1990 году была установлена точечная мутация в 7 экзоне, локализованная в 272 кодоне в ассоциации с гаплотипом 7 ( Apold J.,1990 ).В результате трансверсии G-Т в первом положении 272 кодона (GGA), кодирующего глицин, возникает терминирующий кодон TGA. Следствием этой мутации является синтез полипептидной цепи, укороченной на 40%, что влечет за собой потерю ферментативной активности фенилаланингидроксилазы.
В Швеции также выявлена мутация в 11 экзоне, представляющая собой делецию 364 кодона (CТТ), кодирующего лейцин, в ассоциации с гаплотипом 5 ( Svensson E.,1990 ). Делеция лейцина, локализованного в каталитическом центре фермента, приводит к потере ферментативной активности. У пробанда из Швеции данные мутации представлены в компаундном состоянии - 272:364.
Описаны еще две missense мутации в шведской популяции больных фенилкетонурией. Это мутации в 322 ala-gly и 408 arg-gln кодонах, ассоциированные с гаплотипом 12.
В Норвегии выявлена мутация в первом кодоне (метионин - изолейцин), ассоциированная с гаплотипом 7 ( Svensson E.,1992 ). Авторы работы предполагают, что транцизия G-А приводит к разрушению инициирующего кодона (АТG-АТА), вследствие чего транскрибируемая мРНК не может быть транслирована.
Первой мутацией, выявленной в немецкой популяции ФКУ больных, была мутация,локализованная в 9 экзоне в 311 кодоне ( Lichter-Konecki U.,1988a ; Reiss O.,1988 ). Транзиция Т-C (CТG-CCG) приводила к мутационной замене аминокислот (лейцин-пролин), обусловливающей нестабильность фермента. L-пролин приводит к повороту цепи в существующем альфа-спиральном участке пептида, что резко изменяет вторичную структуру протеина в активном центре фермента и внутриклеточную нестабильность белка. Данную мутацию в 311 кодоне впоследствии описали и в Греции в ассоциации с гаплотипом 7 ( Hofman K.J.,1989 ).
В Германии были впервые идентифицированы мутации в 158 кодоне (CGG-CAG, аргинин-глутамин) в ассоциации с гаплотипом 4 ( Dworniczak B.,1990 ), 245 кодоне (GTG-GТA, валин-валин) в ассоциации с гаплотипом 4 ( Dworniczak B.,1990 ) и 281 кодоне (CCТ-CТТ, пролин-лейцин) в ассоциации с гаплотипами 1 и 4 ( Dworniczak B.,1991a ).
Спустя год мутацию в 158 кодоне описали в Швейцарии в ассоциации с гаплотипом 4 ( Okano Y.,1990a ). Описываемый пробанд был компаундной гетерозиготой, где вторая мутантная ФКУ аллель представляла собой новую точечную мутацию, возникающую в результате транзиции G-А во втором положении 261 кодона (CGA-CAA, аргинин-глутамин) в ассоциации с гаплотипом 1 ( Okano Y.,1990a ).
В Германии и в турецой этнической группе из Болгарии была идентифицирована вторая точечная мутация в 261 кодоне ( Dworniczak B.,1991b ; Bosco P.,1991 ). Транзиция C-Т в первом положении 261 кодона (CGA-TGA) инициировала возникновение преждевременного терминирующего кодона, что вело к утрате каталитической активности фермента.
В Германии и Болгарии были зарегистрированы две общие мутации. Первая мутация представляла собой делецию тимина в 55 кодоне (2 экзон) в ассоциации с гаплотипом 1 ( Eigel A.,1991 ). Делеция тимина в 55 кодоне (ТТТ) приводила к сдвигу рамки считывания и возникновению преждевременного терминирующего кодона в 60 положении мРНК, обусловливая обрыв синтезируемой цепи и полную потерю ферментативной активности.
Вторая мутация являлась сплайсинговой мутацией в 10 интроне (IVS-10 nt 546) в ассоциации в гаплотипом 6 ( Dworniczak B.,1991f ). В случае данной мутации в 546 положении десятого интрона возникает транзиция G-А, вследствие чего создается дополнительный преждевременный акцепторный участок сплайсинга. В результате возникает инсерция 9 нуклеотидов, входящих в состав 10 интрона, в кодирующую часть 11 экзона. И включаются три дополнительные аминокислоты в синтезируемый участок полипептидной цепи (Gln 355 - gly-leu-gln-Tyr 356 ), что обусловливает конформационные изменения в белковой молекуле и потерю каталитической активности ФАГ.
Эта сплайсинговая мутация (IVS-10 nt 546) была выявлена и в Северной Ирландии, и в странах южной Европы (Турции, Италии), в Египте, Израиле ( Dworniczak B.,1991e ; Dworniczak B.,1992 ; Dasovich M.,1991 ; Dianzani I.,1993b ; Kleiman S.,1994 ; Goltsov A.A.,1994 ; Meijer H.,1993 ).
В странах Средиземноморья (Италия, Испания, Франция, Северная Африка) был выявлен спектр мутаций, характерных для данного географического района. Первой мутацией, обнаруженной в этой географической области, была мутация в 280 кодоне седьмого экзона, ассоциированная с новым гаплотипом - 38 ( Lyonnet S.,1989 ). Вследствие транзиции G-A в третьем положении 280 кодона, кодирующего глутаминовую кислоту (GAA), возникал кодон (AAA), соответствующий лизину. Такая мутационная замена аминокислот снижала каталитическую активность фермента ФАГ до 1-3%. Мутация была зафиксирована у трех пациентов с гиперфенилаланинемией. Двое пробандов проживали в Северной Африке (Тунис, Алжир), а один - был эмигрантом первого поколения из Бургундии (Франция). В 1990 году эту мутацию обнаружили в Дании в ассоциации с гаплотипом 1 ( Okano Y.,1990b ).
В последующие годы в районе Средиземноморья были описаны следующие точечные мутации: 19 missense мутаций (48 leu-ser HP3; 164 ile-thr ; 171 gly-ala ; 221 glu-gly HP4; 231 ser-pro , 239 gly-ser ; 244 pro-leu HP12; 252 arg-trp HP1,4; 252 arg-gln ; 259 ala-val ; 261 arg-gln ; 261 arg-trp HP1; 273 ser-phe HP7; 277 tyr-asp ; 280 gly-lys HP38; 281 pro-leu HP 1; 331 phe-leu ; 380 thr-met ; 408 arg-trp ); 1 silent мутация (245 val-val ); 3 nonsense мутации (261 gly-ter ; 272 gly-ter ; 359 ser-ter ) и 3 сплайсинговые мутации (IVS-7 nt1; IVS-10 nt546; IVS12 nt1) ( Konecki D.S.,1991 ; Benit P.,1994a ; Dianzani I.,1991 ; Dianzani I.,1992 ; Dianzani I.,1993b ; Dianzani I.,1994 ; Desviat L.R.,1992 ; Desviat L.R.,1993 ; Perez B.,1992 ; Perez B.,1995 ; Caillaud C.,1992 ; Abadie V.,1989 ; Okano Y.,1991a ; Berthelon M.,1991 ; Labrune P.,1991 ; Lyonnet S.,1989 ; Dworniczak B.,1992 ; Dasovich M.,1991 ; Guldberg P.,1993a ).
Во Французской Канаде в провинции Квебек был описан ряд редких мутаций в гене ФАГ у больных фенилкетонурией, не встречаемых в Европейской части. Этот ряд мутаций представлен 6 missense мутациями в 1 met-val HP2, 65 ile-thr HP8, 309 ala-asp HP7, 338 asp-tyr HP4, 349 ser-pro HP1, 415 asp-asn кодонах и делецией тимина в 352 gly кодоне ( John S.W.M.,1989 ; John S.W.M.,1990 ; John S.W.M.,1992a ; Rozen R.,1994 ).
В Восточном полушарии выявлен ряд мутаций в гене ФАГ у больных фенилкетонурией. Первая мутация в этом географическом районе была описана в Китае в 1989 году ( Wang T.,1989a ). У пробанда с классической формой фенилкетонурии выявили терминирующую (nonsense) мутацию в 111 кодоне (3 экзон), ассоциированную с гаплотипом 4.
Спустя два года, в 1991 году в южном Китае зарегистрировали сплайсинговую мутацию в акцептором участке 4 интрона (IVS-4 nt-1) (Wang T.,1991c ). Данная мутация превалирует в южном Китае и Корее и не встречается в северном Китае и Японии. В том же 1991 году в северном Китае зафиксировали мутацию в 12 экзоне в 413 кодоне (CGC-CCC), ассоциированную с гаплотипом 4 (Wang T.,1991a ). Мутационная замена аминокислот (аргинин-пролин) в 413 положении пептида обусловливает нестабильность белковой молекулы и потерю энзиматической активности (более 3%). Мутация превалирует в северном Китае и Японии и довольно редко встречается в южном Китае. На основе этих данных авторы статей высказывают гипотезу о том, что мутантные аллели (413 и IVS-4 nt-1) имеют различное происхождение, первоначально возникнув в двух различных родоначальных группах, они затем распространились по странам Восточного полушария ( Wang T.,1991a ; Wang T.,1991c ; Okano Y.,1992 ). Авторы предполагают, что мутантный 413 аллель возник в северной Монголии, а затем распространился через северный Китай в Японию ( Okano Y.,1992 ), а мутантный сплайсинговый аллель (IVS-4 nt-1) возник в южной Монголии и путем миграции был занесен в Корею ( Wang T.,1991a ; Okano Y.,1992 ).
К настоящему времени в странах Восточного полушария (Китае, Японии, Корее) в гене фенилаланингидроксилазы человека распространены следующие мутации: 13 missense (56 glu-asp ; 161 phe-ser ; 204 tyr-cys ; 241 arg-cys ; 243 arg-gln ; 247 gly-val ; 255 leu-val ; 345 ala-thr ; 388 val-met ; 408 arg-trp ; 408 arg-gln ; 413 arg-pro ; 418 thr-pro ), 3 nonsense (111 arg-ter ; 326 trp-ter ; 356 tyr-ter ), 1 silent (399 val-val) и 2 сплайсинговые (IVS-4 nt-1; IVS-7 nt+2) мутации ( Wang T.,1989b ; Wang T.,1990a ; Wang T.,1991a ; Wang T.,1991b ; Wang T.,1991c ; Wang T.,1992 ; Okano Y.,1992 ; Okano Y.,1993 ; Okano Y.,1994a ; Okano Y.,1994b ; Li J.,1992a ; Li J.,1992b ; Li J.,1994 ; Fang B.,1991 ; Shirahase W.,1991 ; Huang S.Z.,1991 ; Takahashi K.,1992 ; Lin C.H.,1992 ).
В отдельных странах описаны единичные мутации в гене ФАГ у больных фенилкетонурией, не встречаемые в других странах. Так у негров в США была зафиксирована мутация в 255 leu-ser кодоне (Hofman K.J.,1991 ), в Венгрии - в 243 arg-ter кодоне ( Wang T.,1990a ) и т.д.
К настоящему времени у больных фенилкетонурией в гене ФАГ выявлено относительно небольшое количество делеций. До недавнего времени самой протяженной рассматривалась делеция, размером 6,7 килобазы, целиком включающая в себя третий экзон, выявленная в Йеменской еврейской общине у больных с классической формой фенилкетонурии ( Avigad S.,1987 ; Avigad S.,1990 ). В последнее время при исследовании ФКУ больных из Египта была обнаружена делеция, размером более 10 килобаз, включающая в себя два экзона - 5 и 6 ( Goltsov A.A.,1994 ). Известны также делеции, захватывающие 11 экзон ( Okano Y.,1993 ) и 13 экзон ( Sullivan S.E.,1985 ).
Менее протяженные делеции размером 22 пары оснований в 6 экзоне и 15 пар оснований в 11 экзоне описаны в Польше и у арабов, проживающих в Израиле ( Kleiman S.,1992b ; Benit P.,1994b ; Jaruzelska J.,1992a ). Известны также три делеции, представляющие собой делецию целых кодонов - 39, 94 и 364 кодона ( Guldberg P.,1993b ; Caillaud C.,1990 ; Caillaud C.,1991 ; Svensson E.,1990 ; Svensson E.,1993 ). Описаны также делеции с выпадением двух нуклеотидов в 373 и 221:222 кодонах ( Guldberg P.,1993b ; Benit P.,1994b ) и пять делеций с выпадением одного нуклеотида в 55, 352, 407 и 346 кодонах ( Horst J.,1991 ; Eigel A.,1991 ; Rozen R.,1994 ; Benit P.,1994b ; Guldberg P.,1993b ; Goltsov A.A.,1994 ). Эти делеции приводят к сдвигу рамки считывания (fs) и в некоторых случаях образуют преждевременный терминирующий кодон.
Анализ гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией показал, что все случаи этого наследственного заболевания обусловлены мутациями в различных сайтах данного гена.
Есть данные о том, что различная локализация мутаций по длине гена фенилаланингидроксилазы обусловливает различную степень инактивации фермента фенилаланингидроксилазы ( Okano Y.,1991a ).
