Функции ДНК-полимеразы йота в организме млекопитающих (часть I)
Несмотря на то, что на сегодняшний день эксперименты in vitro с гомогенными очищенными препаратами Pol йота человека и мыши позволили детально выяснить многие интересные и необычные свойства этого фермента, основные функции ДНК-полимеразы млекопитающих in vivo остаются неизвестными.
Наиболее прямым и информативным способом выявления функции любого фермента является метод нокаута - нарушение или выключение функции одного белка на генетическом уровне и последующая оценка биологического эффекта in vivo. Данные, полученные разными группами ученых о роли Pol йота в клетке и организме с использованием этого подхода, оказались весьма противоречивы.
Ранее было продемонстрировано, что культивирование клеток лимфомы Беркитта (BL2) совместно с каким-либо антигеном приводит к 5-10 кратному увеличению количества мутаций в тяжелых цепях V-региона иммуноглобулинов (главным образом в RGYW-последовательностях ) и сопровождается 4 кратным увеличением экспрессии мРНК Pol йота [ Denepoux, 1997 ; Poltoratsky, 2001 ]. Действительно, вскоре было показано, что нокаут (делеция) гена Pol йота в культуре клеток лимфомы Беркитта подавляет соматический гипермутагенез вариабельных областей генов иммуноглобулинов, а восстановление экспрессии фермента в культуре клеток вновь приводит к индукции мутаций с частотой, сопоставимой с таковой в клетках, неподвергавшихся нокауту ( Faili, 2002 ). Эти эксперименты позволили рассматривать Pol йота в качестве главного кандидата на роль GC-мутатора при созревании вариабельных областей генов иммуноглобулинов. Однако, в организме все оказалось по-другому.
Для человека не описано каких-либо заболеваний, связанных с мутациями в гене Pol йота в отличие от ее педшественника Pol эта , дефекты по которой вызывают XP-V фенотип и изменение спектра мутаций при созревании генов иммуноглобулинов. Поэтому большие надежды в поиске функий Pol йота в организме млекопитающих возлагались на эксперименты с нокаутными мышами и инбредными линиями мышей, различающихся по генетическим и физиологическим характеристикам. Экзон-интронная структура Pol йота, а также биохимические свойства ферментов мыши и человека имеют большое сходство ( Wang, 2004 ) ( рис. 6 ).
Однако, несмотря на предпринятые усилия, нокаут гена Pol йота у мышей пока получить не удалось, но была обнаружена линия мышей, с нонсенс-мутацией во втором экзоне гена Rad30B - 129 линия [ McDonald, 2003 ]. Наличие мутации во втором экзоне гена Pol йота теоретически должно приводить к исчезновению ативного фермента в организме мышей 129-й линии и их можно рассматривать в качестве аналога нокаутированных животных. Однако, уровень и спектр мутаций в вариабельных областях генов иммуноглобулинов у этих мышей не отличается от нормы [ McDonald, 2003 ; Shimizu, 2005 ; Martomo, 2006 ]. Поэтому гипотеза об участии Pol йота в гипермутагенезе генов иммуноглобулинов была отвергнута. Причина расхождения результатов, полученных in vivo в культуре клеток и на мышах 129-й линии не известна и является предметом спора ученых.
Более поздние эксперименты позволили предположить, что Pol йота в организме участвует в репликации ДНК, содержащей повреждения, индуцируемые ультрафиолетовым излучением и уретаном .
Сравнительное изучение линий мышей, отличающихся по степени склонности к индуцируемой уретаном аденоме легких показало, что Рol йота является, вероятно, главным и критичным фактором, от которого зависит частота развития этого заболевания у мышей и людей. Предполагается, что разный уровень склонности или устойчивости к заболеванию легочной аденомой может быть вызван полиморфизмом в структуре гена Рol йота, а также различиями в регуляции синтеза активного белка на уровне альтернативного сплайсинга [ Lee, 2003 ; Wang, 2004 ]. Известно, что мыши 129-й линии, несущие стоп-кодон во втором экзоне гена Pol йота, характеризуются высокой чувствительностью к уретан- индуцируемым опухолям легких ( Lee, 2005 ).
В культуре эмбриональных фибробластов мышей 129-й линии было отмечено изменение спектра мутаций, образующихся после воздействия на клетки УФ излучением. Облучение ультрафиолетом мышей 129-й линии, однако, не вызывало какого-либо биологического эффекта, отличного от мышей других линий. Но облучение животных, дефектных дополнительно по второй склонной к ошибкам ДНК-полимеразе - Pol эта - главному ферменту, участвующему в точной репликации поврежденной ультрафиолетом ДНК и защите организма от рака кожи , привело к тому, что опухоли кожи у мышей 129-й линии развивались в среднем на 4 недели раньше, в сравнении с мышами, дефектными только по одной Pol йота ( Dumstorf, 2006 ).
Предполагается, что наблюдаемый эффект является следствием того, что Pol йота, включаясь в синтез поврежденной ультрафиолетом ДНК (T-U циклобутановые димеры), может предотвращать транзиции цитозин-тимин. Цитозины, входящие в состав дипиримидиновых фотопродуктов, легко подвергаются дезаминированию с образованием урацила, напротив которого репликативные высокоточные ДНК-полимеразы встраивают аденин, вызывая мутации. Pol йота встраивает напротив урацила T-U циклобутановых димеров dGTP всего лишь в два раза менее эффективно, чем dATP ( Celewicz, 2005 ; Vaisman, 2006 ).
Имеется также сообщение о том, что в случае воздействии на мышей 129-й линии ультрафиолетового излучения у животных отмечается повышенная частота образования мезенхимальных опухолей (главным образом сарком ) различной локализации ( Ohkumo, 2006 ).
В другой работе поддерживается версия участия Pol йота в репликации ДНК, содержащей повреждения, вызванные УФ излучением. Однако, авторы утверждают, что в отсутствие Pol эта , Pol йота включается напротив поврежденных участков ДНК в высокоошибочный синтез (в частности, встраивает гуанин напротив тимина циклобутановых димеров). Этим объясняется необычный спектр индуцированных ультрафиолетом мутаций (главным образом трансверсии) у людей с пигментной ксеродермой и определяется склонность данной группы пациентов к раку кожи . Гипотеза также имеет под собой экспериментальное подтверждение. Авторы обнаружили редкую линию клеток, полученную от пациентов с пигментной ксеродермой и экспрессирущую сразу две формы Pol йота. Подавление экспрессии одной из форм ДНК-полимеразы снижало частоту уникальных для XP-V фенотипа трансверсий, индуцированных ультрафиолетом, на 50% ( Wang, 1997 ).
