Триозофосфатизомераза
Карта белка триозофосфатизомераза
Н.К.Наградова
Триозофосфатизомераза (triosephosphate isomerase; D-глицер- альдегид-3-фосфат кетол-изомераза, КФ 5.3.1.1) - фермент гликолиза, катализирующий взаимопревращение диоксиацетонфосфата и D-глицеральдегид-3-фосфата. Поскольку лишь последний подвергается дальнейшим превращениям в гликолитическом пути, триозофосфатизоме- раза (ТИМ) абсолютно необходима для протекания этого процесса. Ор- ганизмы, лишенные активности ТИМ, не описаны. Нарушения синтеза этого фермента сопровождаются развитием гемолитической анемии и нервномышечных расстройств.
Скорость триозофосфатизомеразной реакции более чем в 10 раз превышает скорость того же превращения, катализируемого ионом аце- тата. Механизм реакции, установленный в серии работ И.Роз и соатв., заключается в стереоспецифическом отщеплении 1-pro R водорода ди- оксиацетонфосфата или С-2 водорода D-глицеральдегид-3-фосфата с об- разованием цис-енедиол(ат)а. Это промежуточное соединение способно очень медленно отщеплять P с образованием метилглиоксаля.
*ТИМ - димер, состоящий из идентичных суб`единиц с молек. массой около 26 кДа. Аминокислотные последовательности определены для ТИМ из разных организмов - как прокариотических, так и эукариотических Определение пространственной структуры ТИМ, а также развитие генно- инженерных подходов, позволивших исследовать свойства мутантных форм фермента, обеспечили серьезный прогресс в понимании молекуляр- ных механизмов его функционирования. Полипептидная цепь ТИМ склады- вается в бочонкообразную структуру, состоящую из восьми бета-тяжей, соединенных между собой альфа-спиралями. бета-Складчатая структура составляет гидрофобное ядро молекулы, тогда как спирали расположены с внешней ее части (рис. 1.110). Важным элементом структуры служат также подвижные петли; две из них обозначены на рисунке. Петля 1 (остатки 70-80) соединяет третий бета-тяж и третью альфа-спираль, а также составляет интегральную часть области контакта между суб`еди- ницами в димере.
Активный центр располагается в С-концевой части молекулы, в по- лости, ограниченной петлей 2 (остатки 167-176). Там локализован Glu-165, участвующий в катализе как общее основание. Другие функ- ционально важные остатки, входящие в область активного центра: Lys- 12, Glu-97, His-95, Asn-10, Ser-96. Следует отметить, что все эти остатки занимают строго консервативные положения в первичной струк- туре 13 исследованных ТИМ. Значительное число консервативных остат- ков локализованы также в подвижной петле 2.
Современные представления о каталитическом механизме ТИМ можно суммировать следующим образом. Первая стадия реакции - связывание субстрата и его фиксирование в оптимальном для катализа положении реализуется благодаря образованию серии водородных связей между фосфатной группой и остатками Gly-232 и -233, находящимися на N-конце короткой альфа-спирали, обращенном в сторону активного центра. NH-Группы этих остатков и кислородные атомы дианиона фосфа- та оказываются сближенными на расстояния 2,7-2,9 А, что обеспечива- ет образование достаточно прочных водородных связей. Дополнительная фиксация фосфатной группы обеспечивается водородной связью между одним из кислородов и NH-группой остатка Ser-211; четвертая водо- родная связь обеспечивается за счет Gly-171, приходящего в область активного центра при движении петли 2.
Таким образом обеспечивается достаточно жесткое закрепление фосфатного "хвоста" субстрата, обеспечивающее точную ориентацию всей молекулы в области активного центра. Вероятно, такая жесткая фиксация не могла бы быть обеспечена, если бы для связывания фос- фатной группы фермент использовал остатки Lys или Arg, боковые цепи которых обладают значительно большей подвижностью, чем NH-группы основной цепи. Еще одной особенностью активного центра ТИМ является то обстоятельство, что каталитически важный электрофил - His-95 обладает необычными свойствами. Он расположен на N-конце спирально- го сегмента, образованного остатками 95-102, и, следовательно, на- ходится в локальном поле положительных зарядов, понижающих его рК . Это может об`яснить результаты исследований, указывающих на отсут- ствие протонирования His-95 при нейтральных значениях рН. Величина рК данного остатка была экспериментально определена с помощью ме- тода N-ЯМР на мутантном дрожжевом ферменте, в котором все His-остатки за исключением His-95 были заменены на остатки Gln. Му- тант (полностью сохранивший активность) был экспрессирован в E. co- li, выращенной на среде, обогащенной N-His. Согласно полученным результатам рК His-95, составляющая в денатурированном ферменте 6,7, снижается в нативной ТИМ до 4,5. Это прямо свидетельствует о том, что данный остаток выполняет свою каталитическую функцию элек- трофила, находясь в непротонированной форме.
Кристаллографические исследования, проведенные на свободном ферменте и на комплексе ТИМ с аналогом переходного состояния - 2- фосфогликолатом позволили охарактеризовать структурные основы ката- литического механизма ТИМ. Связывание субстрата вызывает конформа- ционные изменения, в результате которых боковая цепь Glu-165 пере- мещается на 2 А и протонируется. Подвижная петля, состоящая из остатков 167-176, смещается на 7 А, закрывая вход в активный центр и вытесняя из него воду. Интересно, что петля перемещается по типу "закрывания века", т.е. движется как "жесткое тело" на двух шарни- рах.
Катализ осуществляется по следующему механизму (рис. 1.111). Начальной стадией является отщепление pro R водорода от первого уг- леродного атома субстрата и протонирование Glu-165. Этот процесс сильно ускоряется благодаря поляризации карбонильной группы суб- страта электрофилом, роль которого выполняет His-95. Замена His-95 на Gln или Asn, снимающая эффект поляризации, снижает скорость ка- тализа соответственно в 100 и в 10 000 раз. Поскольку, как указыва- лось выше, His-95 присутствует в активном центре в непротонирован- ной форме, наиболее вероятным промежуточным соединением является енедиолят, связанный водородной связью с нейтральной имидазольной группой His-95. Затем протон, вовлеченный в эту связь, присоединя- ется к енедиоляту. Последующее отщепление протона от гидроксильной группы при первом углеродном атоме ведет к образованию другого ене- диолята, который быстро превращается в D-глицеральдегид-3-фосфат.
Способность нейтрального имидазола функционировать в качестве электрофильного катализатора - явление необычное в энзимологии. Возможной причиной, по которой фермент использует такой вариант, может быть обеспечение большей эффективности Glu-165 как общего ос- нования. Действительно, пространственная сближенность Glu-165 и His-95 в активном центре ТИМ позволяет допустить, что положительный заряд на имидазоле мог бы снизить основность Glu-165 и повлиять на каталитические свойства фермента.
Важным следствием перемещения петли (остатки 167-176) является дополнительная фиксация фосфатной группы субстрата за счет образо- вания водородной связи с NH-группой Gly-171, входящего в состав петли; это обеспечивает стабилизацию промежуточного соединения в конформации, неблагоприятной для побочной реакции элиминирования фосфата и образования метилглиоксаля (фосфатная группа триозофосфа- та фиксируется в одной плоскости с енедиолом, что по причинам сте- реоэлектронного характера препятствует ее отщеплению).
Убедительная демонстрация центральной роли, которую играет опи- сываемый подвижный элемент структуры в функционировании ТИМ, была получена в экспериментах на мутантной форме белка, полученной путем "вырезания" четырех аминокислотных остатков, составляющих централь- ную часть петли (а именно, Ile-170-Gly-173):
Trp-Ala-Ile-Gly-Thr-Gly-Lys-Thr-Ala-Thr Было установлено, что такое "вырезание" не оказывает существенного влияния на общую конформацию молекулы, однако снижает каталитичес- кую константу в 10 раз. Главной причиной резкого падения триозо- фосфатизомеразной активности оказалось резкое ослабление прочности связывания промежуточного соединения реакции, вследствие чего он легко освобождался в раствор, где и претерпевал быстрое превращение в метилглиоксаль. Таким образом, важнейший элемент каталитического механизма - стабилизация промежуточного соединения, снижающая сво- бодную энергию ведущих к нему переходных состояний (рис.1.111), реализуется молекулой ТИМ благодаря движению петли, переводящему фермент из "открытой" конформации в "закрытую". Описанные особенно- сти структуры и динамики молекулы ТИМ лежат в основе функционально- го совершенства этого фермента, каталитические параметры которого близки к оптимальным.
