Триптофанил-тРНК-синтетаза
Карта белка Триптофанил-тРНК-синтетаза
Г.К.Ковалева, О.О.Фаворова
Триптофанил-тРНК-синтетаза (triptophanyl-tRNA synthetase, ЕС 6.1.1.2, TrpPC) катализирует высокоспецифическое присоединение D- Trp к триптофан-специфической тРНК с использованием энергии расщепления ATP'
Trp + тРНК + ATP Trp-тРНК + AMP + PP
Аминоацил-тРНК-синтетазы (АРС), к которым относится TrpPC, - важнейшие ферменты внерибосомного этапа белкового синтеза, осуществляющие реализацию генетической информации.
Основные свойства бычьей TrpPC.
Бычья TrpPC была впервые выделена из поджелудочной железы и частично очищена в лаборатории Ф.Липмана в 1956 г.; это положило начало изучению АРС из многоклеточных организмов.
TrpPC выявлена в клетках иммунохимическими методами в сочетании с методами световой и электронной микроскопии. Фермент обнаружен в цитозоле, в ассоциатах с полирибосомами и мембранами цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума, а также в ядре, причем в последнем избирательно сосредоточен в диффузном хроматине ядра.
Молекула TrpPC состоит из 2-х идентичных (или сходных) суб`единиц и не содержит дисульфидных связей. Суб`единица TrpPC содержит 475 аминокислотных остатков, последовательность которых была выве- дена на основании данных по секвенированию соответствующей структурной кДНК, молек. масса 53728 Да. Выделены и охарактеризованы формы TrpPC, образующиеся в результате ограниченного протеолиза.
На рис. 1.112 приведена модель пространственной организации TrpPCб построенная на основании данных ограниченного протеолиза и иммунохимического анализа фермента. Для последнего были использованы как поликлональные, так и моноклональные антитела. Согласно предложенной модели полипептидная цепь TrpPC состоит из 2-х доменов: а) ферментативно активного основного ядра (2/3 полипептидной цепи) - С-концевого домена, и б) N-концевого домена (1/3 полипептидной цепи), несущественного для активности. Основное ядро (молек. масса ~40 кДа) состоит из 2-х субдоменов (24 и 14 кДа), в нем на- ходится активный центр.
Полипептидная цепь TrpPC содержит два ключевых пептидных участка, характерных для АРС класса I (см. выше). Гомология бычьей TrpPC с TrpPC из прокариот и митохондрий дрожжей в целом незначительна и высока лишь в области ключевых участков, тогда как TrpPC человека, быка, кролика и мыши высокогомологичны (>90% гомологии).
Молекула бычьей TrpPC содержит небелковые компоненты - ионы Zn , олигосахаридные цепи и остатки фосфата. Содержание ионов Zn по данным атомно-адсорбционного анализа составляет до 0,95 г-атом на моль фермента. Удаление ионов Zn приводит к потере ферментативной активности. Аминоацилирующая функция фермента восстанавливается при добавлении ионов Zn . Олигосахаридная цепочка связана с С-доменом TrpPC, в полипептидной цепи выявлены два потенциальных сайта N-гликозилирования. Существенно отметить, что описанная выше локализация TrpPC в клетке характерна для N-гликозилированных бел- ков. Молекула TrpPC содержит до 4-х остатков фосфата на димер.
В процессе реакции, катализируемой АРС, происходит образование прочно связанного с ферментом промежуточного соединения - аминоациладенилата и последующий перенос активированного аминоацильного остатка на соответствующую тРНК. Основные стадии процесса при функционировании TrpPC приведены ниже.
Mg
TrpPC + Trp + ATP TrpPC (Trp-AMP) + PP (а)
TrpPC (Trp-AMP) + тРНК Trp-тРНК + AMP (б)
Сочетание стадий (а) и (б) дает суммарную реакцию'
Mg TrpPC + Trp + ATP +тРНК Trp-тРНК + AMP + PP +TrpPC (в)
В соответствии с уравнением (а) фермент катализирует реакцию трип- тофанзависимого изотопного обмена ATP-ЗЗ; это обстоятельство используется в одном из методов определения активности. В полной реакции аминоацилирования тРНК (уравнение (в)) активность фермента определяют по скорости включения радиоактивного Trp в Trp-тРНК. Оптимум pH реакции (в) для бычьей TrpPC находится в зоне 8,0-8,2.
Фермент имеет два сайта связывания Trp, а также два сайта связывания Trp-AMP (достаточно стабильного на ферменте) и два сайта связывания тРНК .
На рис. 1.113 приведена кинетическая схема функционирования TrpPC. Она включает три цикла. Цикл III (стадии 1-5, 12а, 12б) показывает ход процесса с участием свободного фермента при сравнительно низких концентрациях Trp и ATP. На стадии 4б тРНК претерпевает конформационные изменения и становится способной к ацилированию аминокислотой (на рисунке обозначено звездочкой). В циклах I и II к комплексу E Trp - тРНК последовательно присоединяются ATP и Trp (стадии 6 и 7); при этом Trp-тРНК и Trp-AMP локализуются в раз- ных активных центрах димерного фермента. Образующийся после стадии 8 тройной комплекс может подвергаться дальнейшим превращениям по одному из двух путей' при низкой концентрации тРНК, недостаточной для насыщения второго центра, происходит диссоциация Trp-тРНК (ста- дии 9а и 9б) и замыкается цикл I; при высокой концентрации тРНК функционирует цикл II, в ходе которого к ферменту, содержащему в одном из центров связанную Trp-тРНК, присоединяется (к другому центру) тРНК (стадия 10а). Далее за счет отрицательной кооперативности предполагается обмен состояниями между двумя молекулами тРНК (стадия 10б), в результате чего Trp-тРНК легко покидет фермент (стадия 11).Отметим некоторые характерные черты функционирования фермента: субстраты присоединяются к ферменту последовательно - сначала ATP, затем Trp; фермент функционирует по тригерному механизму, при котором два эквивалентных в свободном ферменте активных центра при взаимодействии с субстратами переходят в различные состояния, а в ходе реакции взаимодействуют между собой по типу отрицательной кооперативности.
Данные о роли и локализации функционально важных карбоксильных групп фермента были получены при использовании ковалентных производных фермента с субстратом - Trp и продуктом реакции - PP. Триптофанилированное производное TrpPC (Trp-E) - одна из нативных форм, в которой фермент может быть выделен в высокоочищенном состоянии из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Trp-E содержит до 1 моля ковалентно связанного "эндогенного" Trp на моль димера(определяют по способности фермента катализировать изотопный ATP-PP (без добавления Trp). "Эндогенный" Trp может быть замещен на обмен Trp (но не на другие аминокислоты) из раствора (рис. 1.114; (I)). Были исследованы возможные пути превращений Trp-E. Показана способность Trp-E к переносу активированного остатка Trp на тРНК (II) в отсутствие ATP, что прямо указывает на локализацию связанно- го Trp в пределах активного центра фермента. Анализ меченных про- дуктов, полученных после восстановления Trp-E бортритидом натрия (IIШ) или обработки O-[ С] метилгидроксиламином (IV) показал, что Trp образует ангидридную связь с п-карбоксильной группой остатка Glu. При частичном блокировании участвующей в связывании Trp HOOC-группы наблюдалась потеря активности фермента в реакции аминоацилирования тРНК (но не активации Trp), прямо пропорциональная степени блокирования. Эти результаты хорошо согласуются с представ- лением о том, что выявленная HOOC-группа принадлежит активному центру TrpPC и что Trp-E может участвовать в качестве промежуточного соединения на постаденилатной стадии при переносе активированного остатка Trp на тРНК . Образование кинетически компетентных аминоацил-ферментных соединений на постденилатной стадии реакции выявлено недавно для IlePC и LeuPC из E.coli, принадлежащих, как и TrpPC, к классу Ш АРС.
Еще две функционально важных HOOC-группы TrpPC выявлены в результате изучения двух альтернативно образующихся пирофосфорилированных форм фермента. Одна из этих групп, ковалентно связывающая свободный ("внешний") PP, по-видимому, важна для взаимодействия суб`единиц. Ее блокирование приводит к снятию отрицательной кооперативности между суб`единицами и "открытию" второго центра фермента. При этом наблюдается почти 2-кратное увеличение Vmax реакции активации Trp. Другая карбоксильная группа ковалентно связывающая PP, который отщепляется от ATP при образовании триптофаниладенилата на ферменте, по-видимому, также входит в состав активного центра, так как (1) освобождающийся PP не покидает активный центр, (2) AMP "снимает" связанный PP с образованием ATP, который при добавлении Trp может участвовать в образовании Trp-аденилата, и (3) блокирование этой группы приводит к инактивации фермента. Карбоксильные группы, участвующие в образовании пирофосфорилированных форм TrpPC, отличны от карбоксильной группы, связывающей Trp в триптофанил- ферменте.
TrpзС не активирует ни одну из природных аминокислот, кроме L-Trp. Исключительно высокая специфичность (точность) присоединения "своей" аминокислоты к "своей" тРНК - отличительная черта всех APC.
Специфичность аминоацил-тРНК-синтетаз. Аминоацилирование "своей" тРНК определенной аминокислотой, катализируемое АРС, является одной из ключевых реакций, обеспечивающих необходимую точность при биосинтезе белков. Если АРС (E ) ошибочно активирует "чужую" аминокислоту (Y) и далее катализирует ее перенос на "свою" тРНК :
E + Y + тРНК E + Y-тРНК или если она ошибочно этерифицирует "своей" аминокислотой (X) "чужую" тРНК '
E + X + тРНК E + X-тРНК , то каждое из этих событий приведет к ошибке в последовательности синтезируемой полипептидной цепи.
Специфичность к аминокислоте. Дискриминация аминокислот, способных разместиться в активном центре фермента (меньших, чем "своя" аминокислота, или изостеричных ей), определяется предпочтительным связыванием истинного субстрата за счет особенностей его структуры. Известны, однако, примеры недостаточной дискриминации - ошибочное связывание IlePC валина и ValPC изостеричного валину треонина. В обоих случаях ошибочно связывающийся субстрат оказывается способным стимулировать реакцию обмена ATP-PP
Что касается возможности активации больших по размеру "чужих" аминокислот, то обычно исходят из предпосылки, что такие аминокислоты не связываются синтетазой в силу стерических факторов. Действительно, в случае бактериальной ValPC наличие одной дополнительной метиленовой группы в боковой цепи Ile достаточно для того, что- бы его дискриминация достигалась уже на стадии активации.
Эффективность выбора субстратной аминокислоты среди других на стадии связывания свидетельствует о совершенстве структуры активных центров синтетаз. По мнению А.Фершта наблюдаемые значения энергии связывания отдельных групп истинного субстрата АРС, обеспечивающие его предпочтительное связывание в сравнении с близкими по структуре аминокислотами, приближаются к максимально возможным при взаимодействии белковой молекулы с боковой цепью аминокислоты. Специфичность многих АРС на стадии активации достаточна, чтобы с высокой точностью выбирать "свою" аминокислоту среди других, присутствующих в клетке. Однако, у некоторых ферментов, и в первую очередь у IlePC, дискриминирующая способность при активации оказывается недостаточной, и для достижения надлежащей точности белкового синтеза должны существовать специальные механизмы, препятствующие переносу ошибочно активированной "чужой" аминокислоты на тРНК (механизмы коррекции ошибок).
Механизмы коррекции после ошибочной активации аминокислоты.
Добавление тРНК к "правильному" комплексу с Ile-аденилатом приводит к образованию Ile-тРНК , однако,если ввести в систему Val-аденилат, то сколько-нибудь заметного образования Val-тРНК не наблюдается; вместо этого происходит гидролиз "ошибочного" ами- ноациладенилата:
Val тРНК E E [Val-AMP] + PP E + Val + AMP (г)
ATP
Как видно из уравнения (г), в присутствии тРНК и Val IlePC функционирует как ATP-пирофосфатаза. Уравнение (г), описывающее ко- нечный результат процесса коррекции, не раскрывает роли тРНК - индуцирует ли она гидролиз аминоациладенилата, или же служит акцеп- тором ошибочно активированной аминокислоты, а затем подвергается ферментативному деацилированию. Возможные последовательности реакций, катализируемых АРС, можно представить в виде общей схемы:
-PP + РНК E + AK + ATP E [AK-AMP] E AK-тРНК E + AK-тРНК (д)
1 2 3
4 5
E + AK + AMP E + AK + тРНК где AK - аминокислота.
В рамках этой схемы механизм отбраковки "чужой" аминокислоты может включать стадии 1, 2, 5 (гидролиз аминоацил-тРНК) или же ста- дии 1, 4 (гидролиз аминоациладенилата). В каждом из возможных маршрутов коррекции исправление ошибки достигается благодаря введению в реакционный путь необратимого ответвления (стадии 4 или 5), обес- печивающего гидролиз "ошибочного продукта". Прямое доказательство существования механизма коррекции по маршруту 1-2-5 уравнения (д), названного А.Ферштом редактирующим механизмом (editing mechanism), было получено при изучении ошибочного аминоацилирования тРНК треонином, катализируемого ValPC из B. stearothermophilus. Использование в качестве неспецифического субстрата неприродной альфа-аминомасляной кислоты позволило окончательно доказать существование специфического, катализируемого ферментом деацилирования ошибочно аминоацилированных тРНК.
Существование механизма, эквивалентного редактирующему и названного химическим корректированием, было обнаружено в опытах с модифицированными по концевому аденозину молекулами тРНК. Используя модифицированную по неакцептирующей гидроксильной группе рибозы концевого аденозина 3'-дезокси-тРНК , наблюдали ее эффективное ошибочное аминоацилирование Val в присутствии дрожжевой IlePC (нативная тРНК Val не аминоацилируется). При этом ATP-пирофосфатазную активность обнаруживали у фермента только в присутствии нативной тРНК . Таким образом, отсутствие неакцептирующей OH-группы у тРНК приводит к образованию стабильного ошибочного эфира. Эти данные указывают на существенную роль неакцепти- рующей гидроксильной группы рибозы концевого аденозина в фермента- тивном гидролизе тРНК, которая может быть связана с давно известным фактом быстрой миграции аминоацильного остатка в аминоацил-тРНК между 2'- и 3'-положениями рибозы концевого аденозина. При миграции неправильной аминокислоты на неакцептирующую гидроксильную группу
Триптофанил -тРНК-синтетаза: литература
