Терминация трансляции: общие сведения
Достигнув специального нуклеотидного триплета - стоп-кодона , или кодона терминации, - рибосома освобождает синтезированную полипептидную цепочку белка: происходит терминация трансляции. Эпицикл трансляции, включающий инициацию, элонгацию и терминацию, схематически представлен на рис. 1
Терминация белкового синтеза - исключительно ответственный этап в жизни клетки. Если ошибка при элонгации (замена одной аминокислоты на другую) во многих случаях проходит для клетки фенотипически незаметно, то ошибка при "чтении" терминирующего кодона как значащего ведет к сквозному чтению (readthrough), при котором синтез не заканчивается, а на С-конце белка возникает концевая аминокислотная последовательность, кодированная 3'- концом мРНК после терминирующего кодона. В этом случае белок может приобрести новые свойства, инактивироваться или деградировать, что неблагоприятно для клетки. Действительно, экспериментально показано [ Atkinson, ea 1993 ], что искусственно вызванное сквозное прочтение снижает жизнеспособность клеток. С другой стороны, если значащий кодон читается как терминирующий, то это приведет к появлению из-за преждевременной терминации недостроенных полипептидных цепей, лишенных С-конца, что также вызовет самые отрицательные последствия для клетки.
Основополагающие работы, касающиеся терминации белкового синтеза, были опубликованы еще в конце 60-х годов. Тогда были установлены два факта, подтвердившиеся всеми дальнейшими исследованиями.
Во-первых, терминация происходит на рибосомах в тот момент, когда в рибосбмном А-участке (иногда его называют еще декодирующим) находится один из трех терминирующих (или стоп) кодонов - UAA, UAG или UGA, а в Р-участке (или донорном) располагается пептидил-тРНК.
Во-вторых, терминация зависит от присутствия в рибосомах особых белков, получивших название " факторы терминации " (polypeptide chain release factors; RF - у прокариот и eRF - у эукариот).
У бактерий были найдены два фактора ( RF1 и RF2 ), у эукариот - только один (eRF), причем бактериальные факторы могли "читать" по два кодона из трех, а eRF "читал" все три терминирующих кодона. Терминацию трансляции наблюдали как в клетках, так и в бесклеточных и реконструированных системах. Основной вклад в эти достижения внесли группы М. Капекки и Т. Каски (см. обзоры [ Tate, ea 1974 , Caskey ea 1980 ]).
Механизм терминации в этих работах представляли очень простым; связывание фактора терминации с терминирующим кодоном в А-участке рибосомы или с комплексом терминирующего кодона с рибосомной РНК, как предположили позже, открывает доступ воде к пептидил-тРНК, что вызывает реакцию гидролиза и освобождение новосинтезированнои полипептиднои цепи и деацилированной тРНК из рибосом. В последующие 25 лет, т.е. вплоть до 1994 г., никаких существенных изменений в наши представления о терминации трансляции внесено не было, хотя в это время бурно развивались исследования по инициации и элонгации трансляции. Сложилось впечатление, что эта область молекулярной биологии стала классической, вошла в учебники и никаких заметных перемен в ней ждать не приходится. В этот период была установлена аминокислотная последовательность многих бактериальных RF1 и RF2, однако эта информация не помогла уяснить ни механизм терминации, ни эволюционное происхождение факторов терминации (обзор см. [ Tate, ea 1992 ]).
Застой сменился взрывом (так происходит в науке время от времени), который наступил в 1994 г. Сначала две независимые группы исследователей - французская [ Grentzmann, ea 1994 ] и юго-восточная (ученые Японии и Новой Зеландии [ Mikuni, ea 1994 ]), - расшифровали структуру нового фактора бактерий, получившего название RF3, поскольку первые два номера были уже заняты. Эти работы были опубликованы в одном выпуске журнала и цитируются теперь всегда рядом. В опытах 60-х годов уже наблюдали, что терминацию трансляции можно подхлестнуть неким "стимулирующим фактором" [ Milman, ea 1969 , Goldstein, ea 1970 ], однако в то время выделить его в чистом виде не удалось и он надолго выпал из поля зрения исследователей. В названных работах [ Grentzmann, ea 1994 , Mikuni, ea 1994 ] авторы не только установилипервичную структуру нового белка, но и показали, что он кодирован несущественным геном. Иными словами, бактерии могли жить и тогда, когда ген фактора RF3 не функционировал (был делетирован или поврежден путем мутаций).
Оказалось, что белок RF3 относится к так называемым G-белкам, основная особенность которых состоит в способности связывать как GTP, так и GDP, но с разной прочностью. RF3 стимулировал in vitro активность как RF1, так и RF2, т.е. был неспецифичен в отношении этих факторов и трех терминирующих кодонов. В этих работах [ Grentzmann, ea 1994 , Mikuni, ea 1994 ] осталось неясным, в чем же заключается биологическая роль RF3 в бактериальных клетках и обладает ли белок RF3 ферментативной активностью.
Хотя факторы терминации были открыты практически одновременно у бактерий и животных, установление структуры eRF надолго задержалось. Сначала в 1990 г. было сообщено [ Lee, ea 1990 ], что первичная структура eRF установлена, причем она оказалась близкой к структуре бактериальных ферментов- триптофанил-тРНК-синтетаз ( WRS ), чья функция весьма далека от терминации трансляции. Вскоре были установлены первичные структуры WRS быка [ Garret, ea 1991 ] и человека [ Frolova, ea 1991 ], после чего оказалось, что эти структуры на 90% совпадают с той, которая была приписана eRF [ Lee, ea 1990 ]. Тогда же было высказано предположение [ Frolova, ea 1991 ], что структура eRF в работе [ Lee, ea 1990 ] определена неверно, а ошибка возникла из-за неверного определения природы ДНК, подвергнутой секвенированию. Было высказано мнение, что структура, приписываемая eRF, на самом деле принадлежит кроличьей WRS [ Frolova, ea 1991 ]. Вскоре прямые опыты подтвердили справедливость этих подозрений [ Frolova, ea 1993 , Frolova, ea 1993 ]. Оказалось, что действительно расшифрованная ДНК описывает (правда, с ошибками, которые были исправлены [ Frolova, ea 1993 ]) структуру WRS кролика, а отнюдь не eRF (подробнее см. [ Kisselev, ea 1995 ]).
Таким образом, выяснилось, что для эукариот структура eRF осталась неизвестной.
Прорыв наступил в том же 1994 г., когда была раскрыта структура бактериального RF3 . Развязка оказалась драматичной и неожиданной. Когда в результате тщательной очистки eRF из ретикулоцитов кролика (в работе [ Lee, ea 1990 ] этого достичь не удалось, что и стало причиной роковой ошибки) был получен действительно гомогенный белок, удалось провести микросеквенирование ряда пептидов этого белка. Когда структуру этих пептидов "запустили" в банк данных аминокислотных последовательностей, выяснилось [ Frolova, ea 1994 ], что эти или очень близкие аминокислотные последовательности встречаются У ряда описанных ранее белков человека, шпорцевой лягушки, арабидопсиса и пекарских дрожжей. Эти белки зарегистрированы в банках данных под самыми разными названиями, поскольку их функция была неизвестна, хотя первичная структура и установлена. Единственным исключением в этом наборе белков был дрожжевой белок Sup45p , который считали вовлеченным каким-то образом в трансляцию, но по этому поводу никаких биохимических данных в литературе не было, хотя генетикам этот белок был известен очень давно [ Тер-Аванесян ea 1988 ] и возможность его участия в терминации трансляции подозревали [ Инге-Вечтомов ea 1970 ].
Таким образом, оказалось, что существует семейство эукариотических белков, имеющих большое структурное сходство друг с другом ( рис. 1 ), что указывает на сильное давление отбора. Это семейство названо нами eRF1 [ Frolova, ea 1994 ], по аналогии с RF1/2 у прокариот.
В структуре eRF1 обнаружилась одна важная особенность: в нем не было GTP-связывающих мотивов (как, например, в RF3), хотя старые наблюдения говорили о том, что у эукариот GTP стимулирует терминацию in vitro [ Beaudet, ea 1970 ]. Это кажущееся противоречие сразу же привело к предположению, что у эукариот, подобно прокариотам, должен быть еще один фактор, GTP-связываюший, который стимулировал бы терминацию в присутствии GTP. По аналогии его можно было бы назвать eRF3 .
eRF3 открытый вскоре, [ Zhouravleva. ea 1995 ], обладал именно теми свойствами, которые от него ожидали: он содержал GTP-связываюшие мотивы и стимулировал активность eRFl in vitro в присутствии GTP.
Два основных фактора оказывают влияние на эффективность терминации трансляции у эукариот. Этими факторами являются последовательности нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов и структура C-концевой части строящейся полипептидной цепи. Терминирующие кодоны дрожжей по частоте их использования можно расположить в следующий ряд: UAA(53%) > UGA(27%) > UAG(20%). Если анализировать только активно экспрессирующиеся гены, то частота использования UAA оказывается еще большей - 87%. Анализ последовательностей нуклеотидов в окрестностях терминирующих кодонов показал, что и они не являются случайными. Путем исследования способности следующего за стоп-кодоном нуклеотида изменять эффективность его супрессии в гене lacZ было установлено их следующее влияние на усиление терминации трансляции на соответствующих терминирующих кодонах: G>U>A>C (UGA), G>A>U>C (UAA) и A>U>C>G (UAG). Третий от стоп-кодона нижерасположенный нуклеотид оказывает лишь слабое влияние на эффективность терминации. Эти данные были интерпретированы в пользу участия следующего за стоп-кодоном нуклеотида во взаимодействии eRF-факторов с терминирующей рибосомой.
Результаты исследования возможной роли нуклеотидов, предшествующих терминирующему кодону, в терминации трансляции интерпретировать труднее, так как соответствующие замены могут непосредственно изменять первичную структуру С-концевой последовательности строящихся полипептидов. Такие эффекты были обнаружены у E.coli: по крайней мере, две последние аминокислоты оказывают влияние на эффективность терминации синтеза соответствующего белка. У этой бактерии перед кодоном UGA чаще встречаются кодоны UCC(Ser), а также UUC и UUU(Phe), в то время как перед кодоном UUA - кодон AAG(Lys). Эти особенности объясняют возможным участием пептидил-тРНК, находящейся в P-участке рибосом, или самой С-концевой аминокислоты в функционировании RF- факторов в A-участке. Зависимость терминации от природы аминокислот в С-концевой части строящегося полипептида была прямо продемонстрирована для E.coli и дрожжей.
