Редактирование ошибочных нуклеотидов
С точки зрения последующего редактирования ошибок в процессе элонгации цепи ДНК ДНК-полимеразы можно разделить на два типа. К типу ДНК-полимеразам типа A относятся ферменты, имеющие дополнительный активный центр, катализирующий 3'->5'-экзонуклеазный гидролиз . Этот активный центр располагается вблизи центра полимеризации, по-видимому, частично совмещаясь с ним. Его функция проявляется при кинетической задержке элонгации цепи , возникающей в результате включения некомплементарного 3'-нуклеотидного остатка и возникновения ошибочной пары.
В этом случае ДНК-полимеразы включают 3'->5'-экзонуклеазную активность и выщепляют некомплементарный 3'-концевой нуклеотидный остаток.
К группе ДНК-полимераз, содержащих 3'->5'-экзонуклеазный активный центр, относятся, по-видимому, все или почти все фаговые и бактериальные ДНК-полимеразы, а также многие ДНК-полимеразы животных и вирусов животных. Редактирующая активность понижает частоту ошибок еще в 10-100 раз (см. [ Kornberg ea 1982 , Краевский ea 1986 ]).
Имеется также и довольно большое число ДНК-полимераз типа B не содержащих 3'->5'-экзонуклеазной активности.
Например, ДНК-полимеразы eпсилон , ДНК-полимераза дельта и ДНК-полимераза гамма человека такую активность имеют, а ДНК-полимераза aльфа и ДНК-полимераза бета, а также обратные транскриптазы ретровирусов человека, не имеют. Тем не менее, эти ферменты катализируют включение с достаточно высокой точностью (за исключением вирусных обратных транскриптаз, число ошибок для которых примерно 10-4 [ Ono ea 1979 , Sosunov ea 1999 ]).
Применяемые в случае ДНК-полимераз типа Б механизмы коррекции строго не выяснены и, по-видимому, разнообразны. Среди вероятных корректирующих реакций в первую очередь исследовался пирофосфоролиз ошибочно включенного нуклеотидного остатка [см. Kornberg ea 1982 , Краевский ea 1986 ].
В классическом представлении об этой реакции она кажется маловероятной, так как из-за низкого сродства PPi к активному центру ДНК-полимераз ее осуществление требует примерно 1 мМ концентрации PPi в реакционной среде. А этого в клетке нет, в том числе, и из-за присутствия неорганической пирофосфатазы, гидролизующей PPi для сдвига равновесия катализируемой ДНК-полимеразами реакции в сторону элонгации цепи дДНК [см. Kornberg ea 1982 ].
В другом варианте постулировалось удерживание PPi в активном центре ДНК- полимеразы вплоть до транслокации и связывания нового dNTP на последующем этапе реакции [см. Kornberg ea 1982 ]. Однако, никаких прямых доказательств такого механизма реакции до настоящего времени не описано.
Наконец, соучастие в комплексе с ДНК-полимеразой отдельной специфической 3'->5'- экзонуклеазы имеет под собой некоторые доказательства [см. Kornberg ea 1982 ], хотя не кажется нам очевидным. Для этого ДНК-полимераза после ошибочного включения нуклеотидного остатка должна предварительно диссоциировать из ДНК-синтезирующего комплекса с последующей реассоциацией после экзонуклеазного отщепления 3'-концевого нуклеотидного остатка. Среди ДНК-полимераз такой механизм кажется достаточно вероятным для ДНК-полимеразы бета, так как этот фермент работает, по-видимому, главным образом по дистрибютивному механизму, то есть с диссоциацией из комплекса после каждого следующего шага [ Ono ea 1979 ].
В 1998 г. в лаборатории Краевского ИМБ РАН cовместно с лабораторией из Университета Монпелье при исследовании стереохимического контроля биосинтеза ДНК было показано катализируемое рядом ДНК-полимераз образование ди-(дезоксинуклеозид)-тетрафосфата dN-5'-pppp-5'-dN', наблюдаемое при остановке элонгации дДНК [ Sosunov ea 1999 ].
Такая же реакция найдена и исследователями из США при изучении репарации цепей дДНК после терминации их синтеза модифицированными dNTP [ Meyer ea 1998 ].
В соответствии с этой реакцией dNTP связывается с участком, на котором обычно локализуется PPi в реакции катализируемого ДНК- полимеразами пирофосфоролиза, после чего эта молекула dNTP реагирует с 3'-концевым нуклеотидным остатком дДНК и в результате образуется динуклеозидтетрафосфат dN-5'-pppp-5'-dN* ( Рис. 6 ). В отличие от традиционного пирофосфоролиза дДНК концентрация dNTP, требуемая для реакции, на 1-1,5 порядка величины меньше, чем для PPi. Было логично думать, что если dN-5'-pppp-5'-dN' является продуктом ферментативной реакции, то он должен также быть субстратом элонгации. Действительно, мы показали, что dN-5'-pppp-5'-dN' проявляет субстратные свойства в реакции с ДНК-полимеразами, удлинняя цепь дДНК ( Рис. 7 ) [ Victorova ea 1999 ]. При этом dN-5'-pppp-5'-dN' элонгирует цепь любым из двух нуклеотидных остатков этих молекул, что определяется матрицей. Сродство dN-5'-pppp-5'-dN' к различным ДНК-полимеразам варьирует, отличаясь в 10-50 раз, причем в лучших случаях оно равно сродству традиционных субстратов dNTP.
Мы полагаем, что cовокупность реакций из Рис. 6 и Рис. 7 обеспечивает редактирующую активность ДНК-полимераз, не имеющих 3'->5'-экзонуклеазной активности.
