Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТДТ): катализируемые реакции, необходимые двухвалентные катионы
Состав продуктов, синтезированных ТДТ, и скорость полимеризации dNTP зависят от природы двухвалентного катиона, присутствующего в реакционной смеси. Фермент катализирует синтез полинуклеотидов в присутствии Mg2+ , Co2+ или Mn2+ ; предполагается, что роль Me2+ состоит в индуцировании реакционноспособной формы dNTP путем комплексообразования [ Bollum ea 1974 ].
Jolmson и Morgan [ Johnson ea 1976 ] исследовали зависимости скоростей полимеризации четырех нуклеотидов ТДТ в присутствии олигодезоксирибонуклеотидного праймера от природы двухвалентного катиона.
Относительная скорость полимеризации dATP c Mg2+ равна 1
Относительная скорость полимеризации dATP c Со2+ равна 1,1
Относительная скорость полимеризации dGTP с Mg2+ равна 1,6
Относительная скорость полимеризации dGTP с Со2+ равна 2,3
Относительная скорость полимеризации dСTP c Mg2+ равна 0,13
Относительная скорость полимеризации dСTP c Со2+ равна 14
Относительная скорость полимеризации dТTP с Mg2+ равна 0,1
Относительная скорость полимеризации dТTP с Со2+ равна 16
Для dATP скорость полимеризации составила 245 нмоль/мг белка в час. Видно, что максимальная скорость полимеризации пуриновых dNTP достигается в присутствии Mg2+ тогда как присутствие Со2+ обеспечивает максимальную скорость полимеризации пиримидиновых dNTP. Эти данные позволяют предположить, что роль ионов Ме2+ не сводится лишь к комплексообразованию с dNTP. Было показано, что в присутствии Мп2+ dATP сильно ингибирует синтез ДНК, катализируемый ТДТ [ Modak ea 1979 ].
Добавление катионов Zn2+ увеличивает скорость полимеризации dATP в присутствии Mg2+ более чем в 10 раз, но не оказывает никакого эффекта на включение dCTP в полинуклеотидную цепь в присутствии Со2+ [ Kornberg ea 1992 ]. Было высказано предположение, что ТДТ является Zn2+ -содержащим ферментом, причем ион цинка, содержащийся в молекуле фермента, участвует в связывании праймера [ Chang ea 1970 ]. Chang и Bollum [ Chang ea 1990 ] исследовали роль катионов Ме2+ в полимеризации нуклеотидов, катализируемой рекомбинантной ТДТ человека. Однако атомный абсорбционный анализ показал, что ТДТ не содержит в своем составе детектируемых количеств Zn2+. Внесение этого катиона в реакционную смесь увеличивало сродство фермента к праймеру и уменьшало сродство к dNTP; при этом Vmax реакции возрастала.
Кроме того, Chang и Bollum изучили взаимодействие терминированного олигодезоксинуклеотида d(pA)4#dd(pA) с ТДТ. В присутствии только ионов Mg2+ d(pA)4#dd(pA) не ингибировал удлинение d(pA)5#, однако в присутствии катионов Mg2+ и Zn2+ он оказался сильным ингибитором ТДТ, конкурентным по отношению к d (pA) 5.
Авторы сделали вывод, что ионы Zn2+ участвуют во взаимодействии ТДТ с праймерами, причем катионы связываются не с 3'-гидроксилом праймера, а с другими частями молекулы.
