Рибосома: ГТФ-зависимый катализ конформационных переходов
Оказывается, что термодинамически все три шага элонгационного цикла - связывание аминоацил-тРНК, транспептидация и транслокация - это спонтанные процессы, сами по себе идущие с понижением свободной энергии. Действительно, аминоацил-тРНК может специфически, кодонзависимым образом связываться с рибосомой и образовывать нормальный функциональный комплекс ( рис. 2 состояние II ) при отсутствии фактора элонгации EF1 и ГТФ, хотя и значительно медленнее, чем в их присутствии (так называемое неэнзиматическое связывание аминоацил-тРНК). Транспептидация, как известно, всегда катализируется лишь самой рибосомой и является типичной экзергонической (идущей с большим понижением свободной энергии) реакцией. Претранслокационное состояние рибосомы (состояние III на рис. 2 ) термодинамически нестабильно и может медленно скатываться в посттранслокационное состояние спонтанно, без фактора элонгации EF2 и ГТФ (так называемая неэнзиматическая транслокация). В целом, когда в условиях in vitro (в бесклеточных системах) рибосомы снабжены лишь матричным полинуклеотидом и аминоацил-тРНК, возможна медленная неэнзиматическая, или бесфакторная, трансляция без каких-либо дополнительных источников энергии в виде ГТФ или АТФ. Дело в том, что основным источником свободной энергии для производства полезной работы (синтез полипептида со строго заданной аминокислотной последовательностью) в процессе элонгации является реакция транспептидации ( рис. 3 ). В этой реакции сложноэфирная связь молекулы пептидил-тРНК заменяется на пептидную связь в удлиненной пептидил-тРНК. Свободная энергия гидролиза сложноэфирной связи между аминокислотным остатком и рибозой тРНК оценивается величиной от - 7 до - 8 ккал/моль, а свободная энергия гидролиза пептидной связи около - 0,5 ккал/моль. Следовательно, чистый выигрыш свободной энергии в реакции транспептидации составляет около - 7 ккал/моль, то есть сравним со свободной энергией гидролиза АТФ или ГТФ. Другими словами, транспептидация - экзергоническая реакция, способная "накормить" энергией работающую рибосому и обеспечить спонтанное прохождение элонгационного цикла. Для чего же тогда потребляется ГТФ, да еще и по две молекулы на элонгационный цикл? Очевидно, не на производство полезной работы (в термодинамическом смысле слова). Показано, что гидролиз ГТФ в элонгационном цикле при участии рибосомы и факторов элонгации химически не сопряжен ни с какой другой ковалентной реакцией и не связан с образованием какого бы то ни было фосфорилированного интермедиата. Это прямая атака молекулы воды на пирофосфатную связь ГТФ, и освобождаемая свободная энергия гидролиза полностью диссипирует в тепло. Вместе с тем участие факторов элонгации и катализируемый ими гидролиз ГТФ очень сильно (на несколько порядков) увеличивает скорость элонгации. Это позволяет думать, что главная роль гидролиза ГТФ в элонгационном цикле чисто каталитическая, то есть кинетическая, а не термодинамическая. Данное обстоятельство весьма необычно с энзиматической точки зрения. Ведь обычно подразумевается, что катализ, в том числе энзиматический катализ, ускоряет спонтанные реакции без какого-либо потребления дополнительной энергии - свободная энергия освобождается в результате самой катализируемой реакции. Однако вся теория энзиматического катализа разработана для ковалентных реакций. Ее суть состоит в том, что фермент имеет сродство к переходному состоянию катализируемой реакции. Тем самым за счет энергии сродства именно к переходному состоянию исходный субстрат изменяется и фиксируется белком- ферментом в этом состоянии. Энергетический барьер взят. Но образовавшийся комплекс фермента с переходным интермедиатом был бы тупиковым (непродуктивным), если бы интермедиат спонтанно не разваливался на продукты реакции с освобождением свободной энергии, компенсирующей энергию взаимодействия с ферментом. Таким образом, экзергоничность катализируемой реакции необходима для десорбции продукта с фермента. В случае катализа конформационных превращений, каковой наблюдается в элонгационном цикле при EF1-промотируемом связывании аминоацил-тРНК и EF2-промотируемой транслокации ( рис. 2 и рис. 5 ), ситуация иная. Здесь, очевидно, белок-катализатор (EF1 или EF2) тоже имеет сродство к переходному конформационному состоянию рибосомы и тем самым за счет этой энергии взаимодействия фиксирует его. Далее рибосоме надо выйти из этого комплекса, чтобы "упасть" в следующее (продуктивное) состояние. Это было бы невозможно - комплекс оказался бы ловушкой, тупиком, - если бы не участие ГТФ. Природа устроила так, что фактор элонгации может взаимодействовать с рибосомой только после ассоциации с ГТФ: молекула ГТФ за счет сродства к фактору изменяет его конформацию так, что он приобретает сродство к рибосоме. Следовательно, именно фактор элонгации с лигандом ГТФ фиксирует переходное конформационное состояние рибосомы. Но посадка фактора на рибосому индуцирует ГТФазную активность фактора, ГТФ гидролизуется, и как следствие фактор теряет сродство к рибосоме и уходит. Рибосома "падает" с барьера в термодинамически устойчивое состояние. Другими словами, энергия сродства фактора элонгации к переходному конформационному состоянию компенсируется сопутствующей ковалентной реакцией, идущей с понижением свободной энергии. Таким образом, прямой гидролиз ГТФ представляется необходимым для "энзиматического" (фактор-промотируемого) катализа нековалентных конформационных переходов в элонгационном цикле. Основная роль этого гидролиза - разрушение лиганда, обеспечивающего сродство катализатора к переходному конформационному состоянию, чтобы дать возможность выйти из этого промежуточного комплекса и перейти к следующему - продуктивному - состоянию.
