РНК-интерференция: усиление первичного сигнала
Было показано, что in vivo для индукции РНК-интерференции в течение нескольких поколений достаточно очень малых количеств двухцепочечной РНК . Это позволило предположить, что первоначальный сигнал РНК-интерференции может усиливаться клеточными механизмами.
В то же время возможный каталитический характер действия комплексов RISC делает стадию усиления сигнала необязательной. Длинный дуплекс двухцепочечной РНК процессируется на множество siRNA , включающихся в разные комплексы RISC, при этом существует предположение, хотя это и не было прямо показано, что каждый комплекс RISC способен последовательно действовать на многие РНК-мишени, приводя их к деградации.
Что касается усиления сигнала РНК-интерференции, то оно могло бы осуществляться с помощью активности РНК-зависимой РНК-полимеразы (RNA-dependent RNA polymerase - RdRP ).
Клеточный фермент RdRP был найден ранее у растений, однако его функции были неизвестны ( Schiebel et al., 1993a ; Schiebel et al., 1993b ). Было показано, что гены, имеющие гомологию с РНК-зависимой РНК-полимеразой томатов, участвуют в PTGS у растений, quelling у Neurospora и РНК-интерференции в герминальной ткани C. elegans ( Cogoni and Macino, 1999a ; Dalmay et al., 2000b ; Mourrain et al., 2000 ; Smardon et al., 2000 ).
Можно предположить, что RdRP способна использовать в качестве матрицы для синтеза новых РНК либо длинные дуплексы двухцепочечной РНК, либо короткие siRNA.
В нескольких работах были предприняты попытки выявить усиление с помощью RdRP первичного сигнала РНК-интерференции при исследовании активности двухцепочечных РНК, содержащих неравнозначные по своим свойствам смысловую и антисмысловую цепи. В работе Yang с соавторами использовались несовершенные дуплексы двухцепочечной РНК, одна из цепей которых не соответствовала полностью последовательности РНК-мишени ( Yang et al., 2000 ). Parrish с соавторами использовали дуплексы двухцепочечной РНК, в которых одна из цепей содержала химически модифицированные нуклеотиды, препятствующие нормальной РНК-интерференции ( Parrish et al., 2000 ).
В обоих случаях синтез новых цепей РНК с помощью RdRP должен был привести к исчезновению первоначальной неравнозначности смысловой и антисмысловой цепей независимо от существования процесса амплифицикации двухцепочечной РНК или коротких siRNA, возникших при ее процессинге.
Однако в обеих работах было обнаружено, что деградация мРНК существенно нарушается, только когда химическая модификация или несоответствующая последовательность присутствуют в антисмысловой цепи первоначальной двухцепочечной РНК, тогда как нарушения в смысловой цепи имеют гораздо меньший эффект.
Таким образом возникает предположение, что антисмысловая цепь siRNA, осуществляющая узнавание мРНК-мишени, возникает непосредственно из первоначального двухцепочечного РНК-дуплекса, а не синтезируется за счет активности RdRP.
Кроме того, в работе ( Yang et al., 2000 ) было показано, что добавление терминирующего любой синтез РНК кордиципина (3'дезоксиATФ) не нарушает РНК-интерференцию.
