РНК-интерференция: функционирование stRNA
Непосредственной демонстрацией участия механизма РНК-интерференции в регуляции экспрессии клеточных генов стало определение факта необходимости активности DICER для образования так называемых коротких временных РНК ( stRNA - small temporary RNA) let-7 и lin-4 у C. elegans.
Достаточно давно был известен каскад генной регуляции, контролирующий последовательность событий при развитии C. elegans ( Ambros, 1989 ; Liu and Ambros, 1989 ). Было показано, что кроме нормальных, кодирующих белок генов, в этом каскаде участвуют два гена, кодирующие короткие, размером в 21 нуклеотид РНК - let-7 и lin-4 , которые обладают комплементарностью с 3'-нетранслируемым районом мРНК некоторых других генов в этом каскаде.
Возникло предположение, что эти короткие РНК, названные stRNA, способны связываться 3'-концом мРНК, несущих комплементарную последовательность, и приводить к подавлению их трансляции ( Ha et al., 1996 ; Reinhart et al., 2000 ; Wightman et al., 1993 ).
Кроме того, идентичность размеров этих некодирующих РНК с siRNA позволила предположить общий механизм их образования и возможно действия ( Sharp, 2001 ).
Дальнейшие исследования показали, что обе stRNA образуются из более длинных предшественников, способных укладываться в шпилечную структуру, образующую несовершенный двухцепочечный РНК-дуплекс на месте будущей stRNA ( Grishok et al., 2001 ; Hutvagner et al., 2001 ).
Вырезание stRNA из молекулы-предшественника осуществляет белок DICER, мутация в котором приводит к накоплению предшественника и нарушениям в развитии, характерном для других генов в каскаде регуляции последовательности развития ( Grishok et al., 2001 ; Hutvagner et al., 2001 ; Ketting et al., 2001 ).
Кроме белка DICER, на участие в функционировании stRNA были проверены все 24 гена, принадлежащие к семейству Argonaute , найденные в геноме C. elegans. Оказалось, что в образовании stRNA не принимает участие rde-1 , однако участвуют гены alg-1 и alg-2 (argonaute-like gene), которые, в свою очередь, не влияют на искусственную РНК-интерференцию ( Grishok et al., 2001 ).
Однако нарушения функции alg-1 и alg-2 не вызывают исчезновения зрелых stRNA, а лишь уменьшают их количество, аналогично влиянию rde-1 на образование siRNA при РНК-интерференции.
Участие DICER и белков семейства Argonaute в образовании stRNA предполагает их тесную связь с механизмом РНК-интерференции. Однако несмотря на большое количество общих черт механизмы образования и функционирования stRNA и siRNA отличаются:
- stRNA выщепляются из несовершенного дуплекса, содержащего неспаренные нуклеотиды - после образования из предшественника in vivo и даже в экстракте in vitro всегда можно детектировать только одну цепь stRNA ( Hutvagner et al., 2001 ), что предполагает быструю деградацию второй цепи;
- stRNA, комплементарно взаимодействуя с 3'-областью мРНК-мишени, приводят к подавлению трансляции, но не деградации мРНК.
Было предположено, что специфичность сохранения лишь одной цепи stRNA, а также подавление трансляции РНК-мишени определяется не полной комплиментарностью при взаимодействии в дуплексе РНК-предшественника и при взаимодействии с мРНК ( Grishok et al., 2001 ).
Действительно, ранее было обнаружено, что сохранение неспаренных нуклеотидов при взаимодействии с мРНК необходимо для правильного функционирования ( Ha et al., 1996) . Однако при РНК-интерференции процессингу с образованием нормальных siRNA могут подвергаться несовершенные дуплексы двухцепочечной РНК, точно так же как siRNA могут узнавать и направлять деградацию не полностью комплиментарной РНК-мишени ( Elbashir et al., 2001c ; Yang et al., 2000 ).
Следовательно, если наличие неспаренных нуклеотидов и играет роль в этих процессах, то важным, по-видимому, является определенное положение и природа неспаренных нуклеотидов. Скорее всего сиквенс-специфическое узнавание необходимо для сохранения и функционирования лишь одной из двух возможных цепей stRNA.
Участие в функционировании stRNA белков группы Argonaute alg-1 и alg-2 подтверждает описанную гипотезу, согласно которой взаимодействие коротких РНК с различными белками семейства Argonaute во время процессинга из двухцепочечной РНК может определять их дальнейшее функционирование в различных процессах.
По всей видимости, после своего образования stRNA входят в состав белкового комплекса, отличного от RISC . Соответствующие белки могут быть идентифицированы при скрининге генов, участвующих в каскаде, регулирующем последовательность развития, т.к. мутации в них должны приводить к сходному фенотипу.
В то время как lin-4 РНК является специфичной для нескольких близких к C. elegans видов, полностью идентичная let-7 РНК экспрессируется в различных билатеральных организмах от моллюсков до человека ( Pasquinelli et al., 2000 ).
Хотя участие РНК let-7 в развитии в этих организмах еще не было показано, в большинстве случаев она экспрессируется, начиная с определенной стадии развития ( Pasquinelli et al., 2000 ). Образование let-7 РНК из предшественника под действием активности DICER было продемонстрировано у дрозофилы и млекопитающих ( Hutvagner et al., 2001 ).
В целом, работы, проведенные несколькими группами исследователей, показали, что let-7 РНК и lin-4 РНК являются представителями обширного класса коротких некодирующих РНК, названных микроРНК (miRNA) ( Lagos-Quintana et al., 2001 ; Lau et al., 2001 ; Lee and Ambros, 2001 ).
