Гены, участвующие в состоянии ТОП p53-минус
Неясно, какие гены ответственны за очередную остановку пролиферации после прохождения фазы временной отмены старения, имеющей место в отсутствие функции wt p53, но кандидаты - это гены сигнального пути RB . Негативный регулятор роста pRB участвует в регуляции клеточного цикла на протяжении всей жизни нормальных клеток. Во время фазы G1 клеточного цикла pRB недофосфорилирован. В этом состоянии он связывается с представителями семейства транскрипционных факров E2F и предотвращает экспрессию белков, необходимых в S-фазе. Фосфорилирование pRB осуществляется комплексом циклин D/CDK4 и комплексом циклин D/CDK6 по мере приближения клеток к границе G1/S. Это фосфорилирование диссоциирует pRB от E2F и разрешает прохождение через S-фазу (см.обзоры [ Nevins, ea 1992 , Dyson, ea 1994 ]). Ингибитор клеточного цикла p16INK4 связывается с CDK4 и CDK6 в конкуренции с циклином D , тем самым подавляя киназную активность этих CDK, а значит, и фосфорилирование pRB [ Serrano, ea 1993 , Tam, ea 1994 , Schulze, ea 1994 , Delia ea J. 1996 , Serrano, ea 1995 ]. Ряд генетических изменений в клетках IIICF, которые утратили функцию wt p53, позволяет им не останавливаться на уровне удвоений популяции, характерном для состояния ТОП р53-минус ( рисунок ). В число этих изменений входит спонтанная потеря обоих аллелей р16INK4 или трансфекция мутантной плазмиды, которая кодирует белок LTAg SV40, связывающийся с pRB (но не с р53) [ Rogan, ea 1995 , Maclean, ea 1994 , Noble, ea 1996 ]. Таким образом, путь RB скорее всего играет важную роль в остановке пролиферации по типу ТОП р53-минус. В дополнение к индукции состояния ТОП в отсутствие р53 путь RB также, вероятно, кооперируется wt p53 в индукции старения.
В стареющих клетках pRB остается недофосфорилированным, поэтому блок на G1/S в стареющих клетках может быть обусловлен этим конститутивно активным белком pRB [ Stein, ea 1990 , Futreal, ea 1991 ]. Это недофосфорилирование может поддерживаться повышенной экспрессией P16INK4, которая наблюдается в стареющих клетках [ Alcorta, ea 1996 , Hara, ea 1996 , Reznikoff, ea 1996 ]. Фактор, запускающий повышенную экспрессию p16INK4, остается невыясненным. Предполагается наличие петли отрицательной обратной связи между pRB и p16INK4, при помощи, которой инактивация pRB ведет к повышению экспрессии р16INК4 [ Garkavtsev, ea 1997 , Li, ea 1994 , Khleif, ea 1996 ]. Однако, поскольку pRB конститутивно активен в стареющих клетках, должен существовать какой-то другой механизм поддержания высокого уровня экспрессии p16INK4. Участие р53 маловероятно, поскольку в отличие от экспрессии р21 экспрессия р16INK4 не зависит от р53 [ Reznikoff, ea 1996 , Musgrove, ea 1995 ].
Хара с сотр. [ Hara, ea 1996 ] выяснил, что P16INK4 мРНК и кодируемый ею белок очень стабильны и что инактивация pRB при действии LTAg SV40 не повышает скорость транскрипции белка p16INK4 в такой мере, чтобы этим объяснить повышение уровня указанной мРНК в клетках, трансформированных SV40. Они предположили, что р16INK4 просто накапливается с каждым удвоением популяции, что и приводит к его высокому уровню в старых клетках. Одним из последствий конститутивно активной pRB в стареющих клетках является транскрипционная репрессия протоонкогена c-fos [ Campisi, ea 1992 ], белковый продукт которого считают необходимым для пролиферации фибробластов [ Cohen, ea 1989 ]. Однако экспрессия c-fos в стареющих клетках, не является единственной причиной их неспособности к пролиферации, так как введение c-fos в стареющие клетки не вызывает синтез ДНК [ Campisi, ea 1992 ], а индукция экспрессии c-fos форбол-12-миристат-13-ацетатом не повышает синтез ДНК в стареющих фибробластах [ De Tata, ea 1993 ].
Вопрос, на который еще нет окончательного ответа, - достаточно ли одной только инактивации пути RB для того, чтобы позволить нормальным фибробластам человека избежать старения. Мутантный TAg SV40, который связывается с pRB, но не с р53, не был способен увеличивать жизнь нормальных фибробластов [ Maclean, ea 1994 , Lin, ea 1991 ], но делал это в случае спонтанной потери аллеля wt p53 в клетках IIICF от больного LFS [ Maclean, ea 1994 ] ( рисунок ). В другом исследовании обнаружено, что вызванное антисмысловым олигомером торможение синтеза pRB повышает темп пролиферации фибробластов человека, но не избавляет их от старения [ Strauss, ea 1992 ]. В противоречии с этим продолжительность жизни нормальных фибробластов человека, инкубированных с антисмысловым олигомером pRB, увеличивалась на ~10 удвоений популяции за тот предел, при котором контрольные клетки старели. Однако в том же исследовании антисмысловой олигомер р53 не был эффективен, тогда как комбинация антисмыслового pRB и антисмыслового р53 олигомеров пролонгировала жизнь на ~20 удвоений популяции [ Hara, ea 1991 ]. Кроме того введение гена, кодирующего белок Е7 HPV-16 (который связывает pRB) , в нормальные фибробласты человека вызывало небольшое увеличения срока их жизни [ Shay, ea 1993 ]. Таким образом, ответ на вопрос, может ли инактивация pRB приводить к временному избеганию старения, требует дополнительного анализа. Возможно, что инактивация pRB в присутствии wt р53 повышает частоту смерти клеток, что перевешивает любой эффект, повышающий пролиферативный потенциал. Могут также существовать большие различия между реакциями различных линий клеток на инактивацию pRB [ Foster, ea 1996 ]. Какова бы ни была точная роль путей р53 и pRB в индукции состояний ТОП, их значение подтверждается тем хорошо известным фактом, что эти пути часто блокированы у клеточных линий, выведенных из опухолей, и у первичных опухолей. Из всех генов р53 наиболее часто мутирован при раке у человека [ Cheng, ea 1990 , Levine, ea 1991 , Hollestein ea 1991 , Caron ea 1992 , Greenblatt, ea 1994 ] и мутантный ген р53 наследуется многими семействами клеток LFS [ Malkin, ea 1990 , Srivastava, ea 1990 ]. Экспрессия гена RB дикого типа утрачена в клетках многих опухолей [ Friend, ea 1987 , Harbour, ea 1988 , T'Ang, ea 1988 , Bookstein, ea 1990 , Cheng, ea 1990 , Horowitz, ea 1990 , Bookstein, ea 1991 ]. Это семейный ген, ответственный за ретинобластому [ Weinberg, ea 1991 ]. Потеря экспрессии р16INK4-отмечена у клеточных линий, выделенных из опухолей человека, и у клеток первичных опухолей [ Kamb, ea 1994 , Mori, ea 1994 , Nobori, ea 1994 , Okamoto, ea 1994 , Merlo, ea 1995 , Siebert, ea 1995 , Woloschak, ea 1996 ]. Было показано, что p16INK4 - ген семейной меланомы [ Kamb, ea 1994 , Gruis, ea 1995 ].
Инактивация или потеря p16INK4 представляется функционально эквивалентной инактивации или потере pRB. Например, во всех до сих пор известных иммортализованных линиях клеток, включая линии, иммортализованные in vitro и происходящие из опухолей, а также первичные опухоли, неактивны гены pRB или р16, но не оба гена [ Noble, ea 1996 , Li, ea 1994 , Okamoto, ea 1994 , Otterson, ea 1994 , Aagaard, ea 1995 , Parry, ea 1995 , Shapiro, ea 1995 , Whitaker, ea 1995 , Yeager, ea 1995 , Sakaguchi, ea 1996 , Ueki, ea 1996 ]. Суперэкспрессия циклина D1 и/или суперэкспрессия cdk4 характерна для злокачественных клеток человека и, по-видимому, эквивалентна утрате экспрессии р16INK4 или экспрессии pRB [ Lammie, ea 1991 , Schuuring, ea 1992 , Buckiey, ea 1993 , Gillett, ea 1994 , Hinds, ea 1994 , Jares, ea 1994, Baitkova, ea 1995 , Michalides, ea 1995 , Courjal, ea 1996 , Saxena, ea 1996 , Zhang, ea 1997 ].
