Иммортализация вызывается множественными генетическими изменениями
Предполагается, что если клетки, измененные генами SV40, избежали кризис и стали иммортализованными, они уже претерпели генетические или эпигенетические изменения, необходимые для преодоления состояния ТОП кризиса. Многие лаборатории исследовали вопрос о том, зависит ли продолжающаяся пролиферация таких клеток от продолжения экспрессии вирусных онкопротеинов, которые разрешили отмену более раннего состояния ТОП -старения. В двух лабораториях получены линии иммортализованных клеток человека, содержащих термочувствительный мутант LTAg SV40 [ Radna, ea 1989 , Tsuvama, ea 1991 ]. Эти мутантные LTAg работали при 35*, но не функционировали при 39*. Иммортализованные клетки нормально росли при 35*, но при инкубации при 39* они формировали дефектные колонии, быстро прекращали рост, число клеток в S-фазе снижалось и их жизнеспособность постепенно падала. В аналогичном эксперименте иммортализованные клетки человека были созданы трансфекцией нормальных фибробластов плазмидой, кодирующей LTAg SV40, под контролем промотера из вируса опухоли молочной железы мышей. В этой системе LTAg экспрессировался только при росте клеток в присутствии дексаметазона . Когда иммортализованные клетки росли в отсутствие дексаметазона, они останавливались на фазе G1 [ Wright, ea 1989 ] и приобретали фенотип старения, о чем свидетельствовали морфологические и биохимические маркеры [ Shay, ea 1992 ]. Введение антисмыслового LTAg-гена в фибробласты человека, иммортализованные трансформацией SV40, вызывало снижение экспрессии LTAg более, чем на 70%, и частично возвращало клетки к фенотипу старения [ Tanaka, ea 1992 ]. Все эти эксперименты показывают, что продолжение экспрессии белка LTAg SV40, способного инактивировать механизм ТОП-старения, важно даже после инактивации механизма развития ТОП-кризиса. Наиболее простым объяснением этому является то, что каждый из механизмов ТОП независимо может служить эффективным барьером на пути к неограниченной пролиферации. Другое объяснение - что из-за множественности необходимых генетических изменений вероятность преодоления механизма ТОП-кризиса в норме так низка, что это редко случается при отсутствии предшествующих генетических изменений, которые, во-первых, повышают нестабильность генома и, во-вторых, увеличивают популяцию клеток-мишеней. В процессе накопления необходимых генетических изменений количество побочных повреждений может быть настолько большим, что помешает пролиферации даже после восстановления нормальной функции р53 экспериментальными методами. Когда соответствующие методы станут доступными, будет очень интересно определить, может ли теломераза (или другой механизм поддержания теломер) быть активированной в отсутствие других генетических повреждений и, если да, то необходимы ли для иммортализации какие-то другие генетические изменения.
Найден ряд генетических изменений, связанных с отменой состояний постоянной остановки пролиферации, которые являются барьерами на пути к иммортализации клеток. Из этих изменений лучше всего исследованы инактивация р53 и путь pRB, а также активация механизма поддержания теломер. Нашлись и другие генетические изменения, сопровождающие избегание старения или кризиса. Исследования с переносом хромосом показали, что существуют важные генетические изменения, которые еще не охарактеризованы. Некоторые из этих изменений могут быть необходимы для дерепрессии одного или нескольких механизмов поддержания теломер, а некоторые могут быть следствием изменений теломер, тогда как другие явно не связаны с необходимостью поддержания теломер. Выяснение значения каждого из этих изменений и их причинно-следственных связей продолжает быть основной проблемой исследования иммортализации.
