Мутации теломер Tetrahymena блокируют расхождение хромосом в анафазе

Мы открыли новую функцию теломер в разделении хромосом при митозе [ Kirk, ea 1997 ]. В этой работе клетки Tetrahymena thermorphila синтезировали измененные теломерные ДНК. У Т. thernorphila теломеразная РНК клеток дикого типа содержит матричную последовательность GGGGTT для синтеза теломерного повтора. Мы изменили матрицу, чтобы синтезировался теломерный повтор GGGGTTTT, найденный у ряда других ресничатых, и ввели этот измененный ген (ter 1-43 АА) с помощью высококопииного эписомального вектора в клетки дикого типа Т. thermorphila с последующей гиперэкспрессией этого измененного гена. В течение 10-15 клеточных поколений после трансформации темп деления клеток в популяции замедлялся и было обнаружено, что митоз микронуклеусов в этих клетках сильно тормозится. Большая часть трансформированных клеток быстро и сильно укрупняется, приобретая неправильные формы, и после 18-30 удвоений популяции полностью прекращают деления. Неожиданным для нас оказался тот факт, что блокирование деления ядра наступает в анафазе. С помощью трехмерной флуоресцентной микроскопии высокого разрешения было показано, что даже в поздней анафазе мутантиые хроматиды не могут разделиться в средней зоне, что зачастую приводит к двукратному увеличению их нормальной длины. Блокирование разделения дочерних ядер позволяет предположить, что мутантные теломеры мешают полному разделению хромосом. В мутантных клетках анафазный микронуклеус в течение митоза был зачастую того же размера, что и анафазный микронуклеус клеток дикого типа, но, как было описано выше, задержка расхождения концов хромосом препятствовала и расхождению к полюсам делящейся клетки. Несмотря на невозможность полного разделения микронуклеусов, наблюдаются некоторые аспекты протекающего клеточного цикла. Как доказательство - сильное вытягивание мутантного анафазного микронуклеуса, свидетельствующее о продолжении анафазы, видимые попытки образования борозды дробления и чрезвычайное увеличение объема цитоплазмы. Такое же развитие событий предсказывалось, исходя из известных наблюдений над Ciliatae , предпринимающих клеточное деление (во время микронуклеарной анафазы) [ Acil, ea 1996 ]. Клетки Tetrahymena содержат два ядра: обычный, делящийся митотически микронуклеус, и полигеномный, делящийся амитотически макронуклеус. Ранее нами было показано, что деление макронуклеуса также сильно затрудняется при различных изменениях теломерной ДНК, произведенных путем замены оснований в матричной последовательности теломеразной РНК [ Yu, ea 1990 , Lee, ea 1993 , Yt, ea 1991 , Romero, ea 1995 ]. В клетках Tetrahymena дикого типа деление двух типов ядер происходит в различное время клеточного цикла: митоз микронуклеусов завершается перед тем, как макронуклеус амитотически делится, после чего следует цитокинез. В соответствии с этим порядком событий клеточного цикла в клетках с мутантными теломерами макронуклеус никотда не начинал делиться, пока микронуклеус был заблокирован в анафазе. Таким образом, для начала деления макронуклеуса требуется правильное завершение деления микронуклеуса. Следовательно, хотя мутантные теломеры могут также наносить ущерб делению макронуклеуса независимо от фенотипа теломер микронуклеуса, такое ухудшение разделения макронуклеусов не может наблюдаться, пока микронуклеусы митотически блокированы. Какова же природа блокирования ядерного деления, обусловленного мутантными теломерными повторами? Частота, с которой измененные микронуклеарные теломеры препятствуют расхождению в экспериментах, описанных выше, близка к 100% для каждой хроматиды. Если мутантные теломеры распознаются клеткой как "поврежденная" ДНК, может быть запущено блокирование клеточного цикла, как, например, в случае RAD9 -зависимого блокирования, которое наблюдается в ответ на разрыв концов хромосом или утерю теломер у дрожжей [ McEachern, ea 1996 , Sandell, ea 1993 , Acil, ea 1996 ]. Однако такое блокирование клеточного цикла следовало бы ожидать на стадии G2 , т.е. перед митозом [ Wdnert, ea 1994 ]. Вместо этого поразительной особенностью мутантных по теломере клеток Tetrahymena оказалось то, что остановка деления происходила в анафазе, тогда как клеточный цикл во многих своих проявлениях продолжался на фоне этого блокирования. Это совместимо с физической задержкой разделения теломер. Мы предпочитаем модель, в которой теломеры сестринских хроматид в норме соединены до метафазы и это соединение должно распадаться перед расхождением хромосом в анафазе. По нашему предположению в этом и состоит первейшая роль теломер способствовать правильному разделению сестринских хроматид в митозе. Следовательно, мутантная теломерная ДНК не дает теломерам разойтись в анафазе. Очень немного известно о том, как теломеры сестринских хроматид слипаются друг с другом на всем протяжении G2-фазы клеточного цикла и метафазы. Близкое соседство теломер различных хроматид наблюдалось на цитологическом уровне для различных организмов [ Yanagida, ea 1995 ] и при митотическом делении клеток S. pombe межтеломерные ассоциаты наблюдались в G2-фазе [ Dcrnberg, ea 1995 ]. В норме ассоциаты теломер могли бы создаваться с помощью теломеросвязывающих белков Cilfatae , белков Rapl и SIR у дрожжей [ Henderson, ea 1995 ] или TRFI у человека [ Fang, ea 1995 ]. Также было выдвинуто предположение, что удлинение теломерных однонитевых концов у S. cerevisiae в S-фазе могло бы содействовать межтеломерному взаимодействию сестринских хроматид [ Funabiki, ea 1993 ]. Если теломеры участвуют в сцеплении сестринских хроматид, они также должны своевременно разделяться во время расхождения хромосом. Если мутантные теломеры не могут связывать белковые факторы должным образом или если изменения в последовательности ДНК могут менять их структуру, то изменяется топологическое узнавание теломерного комплекса ферментами, такими как топоизомераза II. Топоизомераза II необходима для разделения в анафазе хромосом S. pombe и S. cerevisiae [ Chong, ea 1995 ]. С другой стороны, теломеры могут стать недоступными для таких факторов из-за изменения пространственной организации ядра. Эти возможности остаются пока неисследованными.

Ссылки: