Теломеры: поддержание длин обеспечивается их комплексом с белком rap-1
Удивительный аспект поддержания теломер, - это способность к быстрому восстановлению нормальной длины из удлиненного или укороченного состояний. Клетки имеют систему гомеостаза теломерной длины, поддерживающую постоянство длины теломер в жестких рамках. Таким образом, ситуация, когда длина теломер падает ниже нормы и требует включения механизмов рекомбинации, чрезвычайно редка. Теломерный гомеостаз базируется не только на теломеразе , которая обеспечивает присутствие теломер на концах хромосом, но и на механизмах проверки теломерной длины. Регуляция длины теломер происходит по меньшей мере на двух уровнях. Большая часть негативного контроля длины теломер в дрожжах и клетках человека происходит с участием Rap1-белка , который специфически связывается с дуплексами теломерных повторов [ Krauskopf, ea 1996 , Shore, ea 1997 ]. Его функциональный гомолог в клетках млекопитающих называется TRF1 [ Van Steensel, ea 1997 ]. Число молекул белка Rap1 на данной теломере - это один из сигналов аппарату регуляции длины теломер [ Shore, ea 1996 ].
Однако значительно больший вклад в регуляцию длины теломер вносится за счет другого аспекта взаимодействия: Rapl-белок делает недоступным для взаимодействий крайний повтор на самом конце теломеры. Этот критический компонент гомеостатического поддержания постоянства длины теломер был обнаружен в исследованиях на К. lactis , в которых были изменены и последовательность теломерной ДНК, и Rapl-белок [ Krauskopf, ea 1996 ]. Изменение последовательности теломерных повторов влияет на регуляцию их длины [ McEachern, ea 1995 ]. После ослабления связывания теломер и белка Rapl регуляция ухудшается, даже если внутренние районы теломер представляют собой полноразмерные нормальные тракты дикого типа, к которым дистально добавлены мутированные повторы.
Мутантный ген теломеразной РНК, синтезирующий повторяющиеся последовательности, не связывающиеся с белком Rapl, был введен в клетки К. lactis. В других экспериментах такой измененный ген теломеразной РНК (после периода синтеза под его контролем мутантных теломерных повторов) был заменен геном теломеразной РНК дикого типа [ McEachern, ea 1995 , Krauskopf, ea 1996 ]. Из экспериментальных наблюдений за кинетикой потери контроля теломерной длины стало ясно, что лишь один или несколько дистальных повторов высококритичны для контроля длины. Поэтому мы предположили, что изменение последовательности дистальных теломерных повторов не позволяет белку Rapl занять место на этих теломерных повторах in vivo и потому теломераза получает возможность их удлинять. В простой модели стерического преятствия Rap1-белок, связан с концевым теломерным повтором (повторами), и ограничивает доступ теломеразы к концу теломеры. Другие возможные модели предполагают прямое взаимодействие Rap 1-белка с теломеразой и негативную регуляцию работы теломеразы. Например, Rap1-белок, связанный с теломерной ДНК, может индуцировать конформационные изменения в теломеразе, индуциующие ее полимеразную активность. Возможна и альтернатива: подобное взаимодействме могло бы стимулировать нуклеотическую активность, вызывающую расщепление теломеразы, как это было показано для теломераз Tetrahimena и S. cerevisiae [ Bhattacharyya, ea 1997 , Collins, ea 1993 , Cohn, ea 1995 ]. Кинетика ослабления контроля регуляции длины теломер в двойных мутантах по Rap1 и по теломерным повторам у К. lactis [ Krauskopf, ea 1996 ] однозначно свидетельствует о том, что теломерные комплексы с Rap 1-белком метастабильны на дистальном конце и могут существовать как в доступной, так и в недоступной для теломеразы форме. По сути это напоминает двухстадийную модель установления и отмены транскрипционного молчания (сайленсинга) хроматина во внутренних молчащих локусах типа спаривания S. cerevisiae (ссылки и обзор см. в [44]. В экспериментах на двойных мутантах К. lac , наблюдается постепенный переход популяции теломер от регулируемого к нерегулироваемому состоянию. Это позволяет предположить, что как только первые несколько мутантных теломерных повторов добавляются на теломерный конец, теломерный комплекс с высокой вероятностью теряет прежнюю недоступность для теломеразы. Как только потеря состояния недоступности произошла на любой из теломер его нелегко обратить. С течением времени это ведет к потере контроля над длиной во все возрастающем числе теломер. Поэтому мы предполагаем, что у К. lactis, как и у S. cerevisiа [ Shore, ea 1997 , Fang, ea 1995 , Zakian, ea 1995 , Gilson, ea 1993 , Palladino, 1993 ], Rapl, связавшись с дуплексом теломерной ДНК, индуцирует на теломере формирование структурированного, более высокоупорядоченного хроматина [ Krauskopf, ea 1996 ]. Более того, мы считаем, что важнейшая биологическая функция этого комплекса состоит в кэпировании концов хромосом и регуляции длины теломер. Суммируя, следует заметить, что зависимость расхождения хромосом от правильной последовательности теломер просто поразительна, если учесть, что теломеры обычно составляют менее одной десятитысячной общей длины эукариотической хромосомной ДНК. Важность теломерной ДНК для разделения хромосом в анафазе - еще одна жизненно необходимая функция теломер в активно делящихся клетках. Блокирование всех теломерных функций в ситуации, когда изменена лишь небольшая часть теломерных повторов, делает эти последовательности еще более важными. Эффекты измененной теломерной ДНК проявляются очень быстро. Эти результаты имеют практическое значение, поскольку свидетельствуют том, что измененная теломерная ДНК, а не просто ее укорочение, ведет к блокированию разделения ядра. Мы показали также, что синтез правильной теломерной последовательности напрямую зависит от структуры теломеразной РНК. Таким образом, можно представить ситуацию, когда индуцированные изменения теломеразной РНК заставят ее делать вредные для клетки теломеры, что можно будет применять в борьбе с раковыми или другими патогенными размножающимися клетками. Изменения теломеразной РНК позволяют выявить также интересные свойства самого фермента. Наши данные убеждают в том, что активный сайт теломеразы Tetrahymena (и почти наверняка всех теломераз) таков, что для его правильного функционирования в процессе элонгации необходимы строго специфические [ Strahl, ea 1997 ] взаимодействия между РНК - ее основаниями и структурой - и белком. Как эволюционировала взаимозависимость между функциями белка и нуклеиновой кислоты в этом комплексе - понимание этого важно и для исследования других РНП-частиц, таких как рибосомы или сплайсосомы. К настоящему времени стало ясно, что длина теломер контролируется противоположным действием двух клеточных комплексов, взаимодействующих с теломерной ДНК. Это комплекс теломерной ДНК с белком, прежде всего со структурно связывающим белком Rapl, и энзиматическая машина элонгации теломер - теломераза. Таким образом, действие теломеразы контролируется главным контролером - самой теломерой. Предполагается, что теломеразная активность необходима для поддержания теломер в пролиферирующих клетках человека и что увеличение концентрации теломеразы может способствовать достижению состояния злокачественной трансформации или поддержанию этого состояния. Вероятно, в клетках млекопитающих длина теломер негативно регулируется сходным с Rapl теломеросвязывающим фактором TRF1 [ De Lange, T. 1995 ]. Таким образом, помимо теломеразы мы должны учитывать и другие факторы поддержания постоянства длины теломер в клетках человека.
