ALT- альтернативные пути удлинения теломер млекопитающих и дрожжей
В некоторых случаях стабилизация теломер достигается за счет одного или нескольких альтернативных механизмов (ALT - Alternative Lengthening of Telomeres) (см. обзоры [ Bryan, ea 1997 ]). Линии клеток ALT характеризуются одновременным отсутствием определимой активности теломеразы и наличием теломер очень различных длин - от весьма коротких до значительно превышающих нормальную длину [ Bryan, ea 1995 ]. Эксперименты на дрожжах и млекопитающих, в которых была инактивирована теломераза , показали, что размер теломер постепенно сокращается и это приводит к гибели клеток [ Pardue ea 1999 , Nugent ea 1998 , Blasco ea 1999 ]. Однако у части клеток индуцируется альтернативный механизм элонгации теломер (ALT) основанный на ДНК-зависимом синтезе ДНК, т.е. обычной репликации , либо на нереципрокной рекомбинации (далее в тексте конверсия/рекомбинация ). Опыты на двух видах дрожжей показали, что ALT может служить запасным механизмом, спасая клетки от гибели вследствие потери теломер, к которому приводит инактивация теломеразы [ Pardue ea 1999 , Biessmann ea 1997 ]. Так у S.cerevisiae делеция гена est2 , кодирующего каталитическую субъединицу теломеразы, привела к гибели большей части клеток. Однако небольшая фракция клеток выжила и не потеряла способность к делению. Теломеры этих клеток состояли либо из субтеломерных повторов, либо из кодируемых теломеразой коротких повторов (С1-3А). Для удлинения теломер был необходим продукт гена RAD52 , который является ключевым в процессе митотической рекомбинации .
Аналогично, делеция гена теломеразной РНК в Kluyveromyces lactis привела к гибели большей части делящихся клеток, но вновь была выявлена выжившая субпопуляция клеток. В этом случае наблюдалось удлинение теломер в результате конверсии/рекомбинации между теломерными повторами. Эти исследования показывают, что удлинение теломер, основанное на конверсии/рекомбинации между теломерными или субтеломерными повторами, может являться альтернативой теломеразному пути поддержания структуры теломер. Очевидно, что у дрожжей существует механизм, который блокирует использование конверсии/рекомбинации для удлинения теломерных последовательностей. Поэтому только небольшая часть мутантных клеток с инактивированной теломеразой может поддерживать структуру теломер подобным способом. Возможно, в этих клетках произошли мутации, которые нарушили белковый комплекс, блокирующий конверсию/рекомбинацию на конце хромосомы. Ингибирование черезмерного удлинения теломер с помощью ALT можно объяснить тем, что эти механизмы сложно точно регулировать. Так, теломеры в выживших клетках, лишенных теломеразной активности, имели вариабельный размер и часто были очень длинными. В то время как теломераза точно поддерживает длину теломер дрожжей в пределах 250-400 п.н. Определенный размер теломер имеет большое значение, так как при восстановлении активности теломеразы в клетках S. cerevisiae происходит быстрое удаление лишних субтеломерных повторов и восстановление правильной структуры и нормальной длины теломер.
Поддержание теломер в иммортализованных клеточных линиях человека , не обнаруживающих теломеразной активности, также происходит при помощи ALT-механмзмов [ Bryan ea 1995 , Bryan ea 1997 ]. Интересно, что как и в случае дрожжевых клеток с инактивированной теломеразой, эти клеточные линии человека имеют очень длинные и гетерогенные по размеру и структуре теломеры. Аналогично было показано, что часть раковых клеточных линий не имеет детектируемого уровня теломеразной активности и использует ALT-механизмы. В этом плане принципиальное значение имеет эксперимент по инактивации теломеразы у мышей Mus musculus путем делеции гена, который кодирует РНК-матрицу теломеразы [ Blasco ea 1997 , Rudolph ea 1999 ]. Как и предполагалось, в отсутствие теломеразы теломеры мышей укорачивались в среднем на 4,8 + 2,4 т.п.н. за одно поколение, при изначальной длине теломер примерно 20-60 т.п.н. В шестом поколении теломерные последовательности не были обнаружены у 5% хромосом в эмбриональных фибробластах. Отмечены некоторые кариотипические отклонения, но, несмотря на это, клетки данного поколения мышей могли формировать иммортальные клеточные линии, а также инициировать формирование опухолей при пересадке.
Было замечено, что у мышей 4-6-го поколения с сильно укороченными теломерами, деление клеток при гемопоэзе сопровождается удлинением теломер. Эти результаты показывают, что удлинение теломер может происходить не только с помощью теломеразы. Следствием принятия модели укладки конца теломеры в конформацию Т-петли является то, что образовавшаяся на конце Д-петля напоминает структуру репликационной вилки, т.е. теломера, находясь в Т-петле, может потенциально удлиняться с помощью обычной репликации, используя теломерные повторы в качестве матрицы. Таким образом, для предотвращения бесконтрольной репликации ДНК теломеры должны существовать специальные белки, блокирующие одноцепочечный G-хвост. Однако, как и у дрожжей, инактивация теломеразы может привести к деблокированию ALT у части активно пролиферирующих клеток мыши.
