Система негативной селекции трансформированных генов
Рассмотрим схему на рис. 11 . Здесь происходит направленное замещение протоонкогена int-2, гомологичного фактору роста фибробластов. Этот протоонкоген, активируется в молочной железе у мышей, когда рядом с ним внедряется MMTV. В данном случае он замещается геном устойчивости к неомицину. Как и в предыдущем случае, вектор внедрения содержит часть, гомологичную гену int-2. А вместо одного из экзонов вставлен ген neo. Давайте так: я не буду вдаваться в детали устройства гена neo в этом случае и для простоты приму, что все здесь точно так же, как и в случае замещения гена hprt. Но вот существенное отличие вектора от предыдущего: на одном из его концов содержится ген HSV-tk, имеющий свой собственный промотор. Когда происходит двойная гомологичная рекомбинация, условно обозначенная крестиками на рисунке, то ген HSV-tk не переносится в геном. Он остается отделенным от вектора. В результате получаются клетки с генотипом neor, HSV-tk - . Если же происходит негомологичная рекомбинация, которая чаще всего происходит по концам линейного вектора [ Capecchi, 1989 ], то тогда ген тимидинкиназы встраивается в геном и клетки становятся neor, HSV-tk + . Два типа клеток легко различить. Первые должна расти в присутствии антибиотика G418 и в присутствии противовирусного препарата ганцикловира . Клетки же, получившие порцию чужеродной ДНК в негомологичную позицию, должны расти в присутствии неомицина, но погибать в присутствии ганцикловира вследствие экспрессии герпесной тимидинкиназы.
Это так называемая позитивно-негативная селекция - ПНС ( PNS , если по английски). Она позволяет увеличить содержание в смеси тех клеток, которые получились в результате гомологичной рекомбинации. В настоящее время существует множество вариантов, позволяющих усилить селекцию, но мы не будем их рассматривать, ограничившись принципами, изложенными выше. Вы легко можете сами изобрести усовершенствованные векторы. Например, можно использовать ген neo, лишенный промотора, и, таким образом, зависящий в своей экспрессии от промотора гена, в который он встроен . Поскольку вероятность случайного встраивания вблизи промотора в геноме невелика, то сам факт экспрессии устойчивости к неомицину свидетельствует о неслучайном встраивании. Можно вместо тимидинкиназы использовать другой ген позволяющий добиваться той же цели. Например, фрагмент гена дифтерийного токсина , кодирующий его А-цепь. Продукт этого гена токсичен для клеток, в которых он экспрессируется. Он ингибирует синтез белка. Таким образом, если он встраивается в геном вместе с вектором и экспрессируется, то он убивает клетки. Если же произошла гомологичная рекомбинация, то он отщепляется и клетки жизнеспособны. И многое другое можно изобрести, но принцип позитивно-негативной селекции останется. Понятно ли вам, что такая рекомбинация лучше всего селектируется в случае генов, которые экспрессируются в эмбриональных клетках. Для неэкспрессирующихся генов должна использоваться другая тактика, поскольку устойчивость к неомицину не будет проявляться.
Раз уж мы упомянули бактериальный ген gpt, то грех не сказать , что и он используется для позитивной селекции на селективных средах с микофеноловой кислотой (вернитесь к рис 9 ).
