Рекомбинация гомологичная: факторы, влияющие на частоту
Уже в первых работах по таргетингу генов было отмечено, что отношение гомологичной рекомбинации к негомологичной увеличивается в 20-40 раз при увеличении общей длины гомологичных последовательностей с 4 до 9,3 т.п. н. ( Thomas K.R., ea., 1987 ). В дальнейшем этот вывод был подтвержден в более детальных работах P.Hasty исоавт. ( Hasty P., ea., 1991 ; Hasty P., ea., 1991 ). Используя векторы замещения и инсерции, эти авторы обнаружили, что абсолютная частота таргетинга возрастала по крайней мере в 200 раз при увеличении в векторе длин гомологичных гену последовательностей с 1,3 до 6,8 т.п.н. Детальный анализ, проведенный с векторами замещения показал возможность осуществления гомологичной рекомбинации и при длине гомологичной последовательности на одном из концов вектора, равной 472 п.н., в случае наличия протяженной гомологичной последовательности на другом конце. Имеющиеся данные позволяют заключить, что наиболее эффективно гомологичгая рекомбинация осуществляется при суммарной длине гомологичных последовательностей в векторе от 5 до 10 т.п.н. и при минимальной длине одного из гомологичных плечей вектора порядка 2 т.п.н. ( Thomas K.R., ea., 1992 )
Проведенные эксперименты свидетельствуют о большом влиянии степени гомологии между вступающими во взаимодействие экзогенными и эндогенными последовательностями на частоту гомологичной рекомбинации. Поскольку основными линиями ЭС-клеток, которые используются для таргетирования и последующего эффективного получения химерных мышей, являются линии 129/SV и производные от нее D3, 14.1 и AB1, то в связи с важностью гомологии между рекомбинирующими последовательностями в большом числе работ вектор конструируют на базе генов, клонированных из банков генов этих же линий ЭС-клеток. Важность использования для гомологичной рекомбинации изогенной ДНК продемонстрирована в ряде работ. При проведении таргетинга гена Rb в ЭС-клетках мышей линии 129 показано, что гомологичная рекомбинация с вектором, содержащим изогенные последовательности гена Rb, в 20 раз более эффективна, чем при использовании конструкта с геном Rb из мышей линии BALB/c ( te Riele H., ea., 1992 ). Частота таргетинга с вектором, в котором 17 т.п.н. представлено изогенным геном, составила 78%. Различия между генами Rb у этих 2 линий мышей были незначительными: приблизительный анализ показал, что в среднем на 160 п.н. приходится одно замещение или делеция/инсерция п.н.
В другой работе при электропорации ЭС-клеток вектором замещения с изогенным геном креатинкиназы М получили в 25 раз большую эффективность таргетинга по сравнению с неизогенным геном ( Deursen van J., ea., 1992 ), хотя различия в степени гомологии в данном случае были невелики (2%). соотношение гомологичной рекомбинации с негомологичной при использовании вектора с изогенным геном составляло 1/8. Высокая (от 4 до 10%) частота таргетинга получена рядом авторов при замене в векторе замещения промотора у гена neo (pgk-neo) и при использовании длинных (около 9 т.п.н. с 5 -конца по отношению к гену neo) изогенных гомологичных фрагментов: для генов PDGF B ( Leveen P., ea., 1994 ) , mGluRl ( Aiba A., ea., 1994 ), GFAP ( Pekny M., ea., 1995 ).
Интересно, что на частоту гомологичной рекомбинации, по-видимому, не оказывает существенного влияния наличие в векторе больших блоков негомологичных последовательностей ( Capecchi M.R., 1989 ; Mansour S.L., ea., 1990 ). M.Capecchi ( Capecchi M.R., 1989 ), например, отмечает этот факт для случаев использования векторов с двумя ТК-генами вместо одного.
Среди других факторов, влияющих на эффективность таргеттинга, можно отметить такие, как топология вектора, уровень экспрессии таргетируемого гена, его хромосомная локализация. Считается, что гомологичная рекомбинация в некоторых локусах может не выявляться совсем из-за низкого уровня экспрессии в них маркерного гена ( te Riele H., ea., 1992 ). Несмотря на это, к настоящему времени осуществлен таргетинг большого числа структурных генов в ЭС-клетках мышей, в результате чего получен ряд принципиально новых данных о функции отдельных генов в целом организме.
