Трансгеноз: адресное встраивание генов в геном
Как же осуществляется направленное изменение генов в эмбриональных стволовых клетках ? Ведь хотя клетки животных и способны встраивать чужеродную ДНК по механизму гомологичной рекомбинации , гораздо чаще встраивание происходит путем случайной рекомбинации между концевыми участками линейной чужеродной ДНК и геномом. Частота гомологичной рекомбинации очень низка, и в зависимости от локуса может быть - 10-3 - 10-7. Примерно 100 -1000 случайных встраиваний происходит на одно гомологичное [ Pascoe ea 1992 ], и есть данные, что это еще более редкое событие. Направленное встраивание основывается не на увеличении частоты гомологичной рекомбинации, а на селекции тех редких рекомбинантов, которые образуются за счет гомологичной рекомбинации.
Давайте посмотрим на рис. 7 . Там вы увидите одну из схем направленного замещения генов. Это одна из первых схем, в которой ген, кодирующий гипоксантинфосфорибозилтрансферазу ген hprt расположенный Х-хромосоме, замещается геном устойчивости к неомицину. В случае клеток животных используют производное неомицина G418 ). Замещение приводит к инактивации гена, к его нокауту . Мы говорим о нокаутированных по какому либо гену животных, когда они не содержат данного гена в функционально пригодном состоянии. Поскольку в данном случае замещаемый ген расположен на Х-хромосоме, то в клетках, взятых от мужской особи, он гемизиготен , т.е. представлен в клетке единственной аллелью. Поэтому его нокаут упрощается. Если в случае генов, расположенных на аутосомах для нокаута необходимо инактивировать обе гомологичные копии, то здесь - только одну. Другим преимуществом этого гена для проведения нокаута является легкая селекция клеток мутантных по нему - они могут расти на среде, содержащей 6-тиогуанин, тогда как клетки , содержащие нормальный фермент на такой среде погибают. И вот здесь мы поговорим о Методах селекции трансформированных соматических клеток
