Гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазa (ГФРТ, HPRT)

Карта белка гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы

Рекомендуемое название: гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазa ( ГФРТ; hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase - HPRT; EC 2.4.2.8. ). Другие названия: IMP-пирофосфорилаза, трансфосфорибозидаза. 

Гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазa - ГФРТ; hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase - HPRT; EC 2.4.2.8. ) катализирует реакции IMP+PPi=HYPX+PRPP и GMP+PPi=GUA+PRPP, осуществляя превращение пуриновых оснований - гуанина и гипоксантина в соответствующие мононуклеотиды при участии 5-фосфорибозил-1-пирофосфата ( Caskey C.T.,1979 ; Stout J.T.,1985 ; Wilson J.M.,1983e ).

Гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазa - цитоплазматический фермент, находящийся во многих тканях человека. Наибольшая активность гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы отмечается в тканях мозга . Фермент  выделен в чистом виде из некоторых тканей человека - эритроцитов ( Krenitsky T.A.,1969 ; Arnold W.J.,1971 ; Olsen A.S.,1974 ; Ghangas G.S.,1975 ) и культуры клеток лимфобластов ( Wilson J.M.,1982a ). 

Строение фермента определяет структурный ген HPRT , локализованный на X-хромосоме .

HPRT - растворимый цитоплазматический фермент, широко распространенный в тканях человека [ Rosenbloom F.,1967 ]. Наиболее высокая активность HPRT, как уже отмечалось выше,  содержится в клетках тканей мозга у человека,обезьяны, крысы, мыши [ Kelley W.N.,1983 ].Активность в мозге человека составляет 0,05% от общего растворимого белка [ Rosenbloom F.,1967 ].

Активность у лошади, кролика, крысы и мыши также выше в тканях мозга, чем в скелетных мышцах; у лошади, в отличие от других животных наиболее высокая активность в тимусе. У человека активность HPRT убывает от 294 до 13 нмоль/час/мг белка в ряду: церебральная кора мозга - базальный ганглий - печень - тимус - почки - сердце - скелетные мышцы [ Hurkness R.A.,1990 ].

В норме высокую активность HPRT имеют также эритроциты, лейкоциты, яичники [ Ташева Т., 1980 ].

HPRT - тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц с молекулярным весом 24470 Да ( Holden J.A.,1978 ); Wilson J.M.,1982b ; Zannis V.I.,1980;  Silverman L.J.,1987 ). Гетерогенность фермента связана с посттрансляционными модификациями в первичной структуре [ Wilson J.M.,1983 ]. В зависимости от локализации фермента pH-оптимум катализируемых реакций несколько отличается,  в эритроцитах человека нет заметных изменений активности HPRT в области pH 7,1-9,1 [ Krenitsky T.A.,1969 ].

Хорошими субстратами HPRT эритроцитов человека являются гипоксантин, гуанин, 6-меркаптопурин [ Krenitsky T.A.,1969 ]. Значения Km для HPRT из эритроцитов человека составляют для гипоксантина 1,7х10-5 M и для гуанина 5,0х10-6 M.. Близкие значения получены для этих субстратов в случае печени овцы , мозга крысы , клеток 755 аденокарциномы ; значение Km для HPRT из эритроцитов человека находятся по разным данным в пределах 5,5х10-5 - 2х10-4 M , из клеток 755 аденокарциномы значения Km для PRPP было равно 3,6х10-5 M - 1,2х10-4 M [ Kelley W.N.,1983 ]. Наиболее высокая активность HPRT найдена в присутствии ионов Mg2+ в концентрациях 5-20 мМ При более высоких концентрациях ионов Mg наблюдается ингибирование активности [ Kelley W.N.,1983 ]. GMP, GDP и GTP - более сильные ингибиторы HPRT, чем  IMP, конкурентные по отношению к PRPP и неконкурентные по отношению к гипоксантину [ Krenitsky T.A.,1969 ].

Кривые зависимости скорости реакции, катализируемой HPRT, от концентрации PRPP имеют гиперболическую зависимость при более щелочных pH и S-образную при pH7,5 и ниже [ Kelley W.N.,1983 ].

В отношении существования изоферментов HPRT существуют спорные мнения. По некоторым данным изоферменты HPRT иммунологически идентичны и незначительно отличаются по удельной активности, степени ингибирования GMP (1mM) и Mg2+-PRPP, отличаются изоэлектрическими точками: при изоэлектрическом фокусировании обнаружены три пика с pI - (1) 5,7;5,7;5,6; (2) 5,9; 5,9; 5,7; (3) 6,0; 6,0; 5,9. Молекулярные массы трех изоферментов составляют 34000, 34600 и 34700 Да [ Arnold W.J.,1971 ].

Для HPRT из разных источников pI несколько отличаются: из эритроцитов человека в данном определении - 5,1- 5,6, КВ-клеток человека 5,8-6,1; мозга и печени хомяка - 6,28 6,4 и 6,6; L-клеток мыши 6,2-6,5 [ Molamud D.,1978 ].

В мозге человека обнаружены два изофермента, отличающиеся по молекулярной массе (69000 и 77000 Да), оптимуму pH (8,4 и 7,0-10,5), значениям Kmдля гипоксантина (13 и 33 мкМ) и гуанина (3,4 и 5,6 мкМ, соответственно) [ Ikeda K.,1984 ]. Отрицание существования реальных изоферментов HPRT отмечено [ Straks M.,1978 ].

Электрофоретическая гетерогенность HPRT, вероятно, не обусловлена генетическими изменениями в белке и не имеет определяющего функционального значения [ Kelley W.N.,1983 ].

HPRT-тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц с молекулярной массой 24470 Да (217 остатков аминокислот). mRNA кодирует HPRT из 218 аминокислот, но затем с N-конца удаляется Met и ацетилируется следующий аминокислотный остаток - Ala. Одна из модификаций фермента - HPRT с частично дезаминированными Asp- 106 [ Silverman L.J.,1987 ; Wilson J.M.,1982 ; Wilson J.M.,1983 ].

Гетерогенность фермента связана с пострансляционными модификациями в первичной структуре [ Wilson J.M.,1983 ]. В зависимости от условий HPRT эритроцитов человека существует в тетрамерной форме (105000-11000 Да), димерной (52000-55000 Да) или тримерной формы, последняя в отсутствие PRPP. Молекулярная масса субъединицы HPRT человека (эритроциты) и китайского хомячка (печень) близка [ Strauss M.,1978 ]. HPRT не содержит глюкозамина, сиаловых кислот, гексозы, но имеет два остатка цистеина [ Muensch H.,1977 ].

При сравнении свойств нормальной HPRT человека и одной из мутантных форм обнаружено, что они отличаются по оптимуму pH (9 и 8 соответственно) и степени ингибирования KCI - в норме фермент менее чувствителен к ингибированию KCI, а мутантная форма полностью ингибируется при 316 мМ KCI [ Carter-Edwards T.,1989 ].

Низкая активность HPRT отмечена в культуре фибробластов человека. Значение Kmдля гипоксантина составляло 26 мкМ, Vmax 1761 мкЕд/мг белка. Высокие концентрации субстратов гипоксантина и гуанина ингибировали активность HPRT без изменения значений Km и Vmax; значение Km для гипоксантина было равно 80 мкМ [ Steyn M.,1984 ]. Мононуклеотиды ингибировали HPRT эритроцитов человека конкурентно по отношению к PRPP и неконкурентно по отношению к гипоксантину. GMP, GDP и GTP более сильные ингибиторы, чем IMP.

При низких концентрациях Mg2+PPi ингибировал активность HPRT. PHMB (п-хлормеркурийбензоат), N-этилмалеимид инактивировали HPRT [ Kremitsky T.A.,1969 ]. Фосфаты карбоциклических нуклеозидных аналогов - ингибиторы HPRT . Карбоциклический GMP более сильный ингибитор HPRT культуры клеток L1210, чем карбоциклический IMP. 1 мкМ карбоциклический GMP ингибирует образование GMP, катализируемое HPRT, на 50% [ Bennett L.L.J.,1985 ].

Увеличение активности HPRT наблюдается у крыс при постнатальном развитии.Активность достигает максимума с первым появлением сперматозоидов в семенных канальцах [ Allsop J.,1986].Активность HPRT возрастает в 3 раза от 15 до 20 дней жизни крысы [ Gutesohn W.,1972 ; Allsop J.,1980 ].Быстрое увеличение активности HPRT происходит в первые три дня при развитии эмбрионов кролика [ Epstein C.J.,1970 ].

Активность HPRT значительно увеличена в лейкоцитах пациентов с острой миелоцитарной лейкемией по сравнению с нормальными лейкоцитами [ Smith J.L.,1971 ].

Синдром Леша-Найхана обусловлен нарушением метаболизма пуриновых оснований в результате генетически обусловленного дефицита фермента гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы ( Sculley D.G.,1992 ; Seegmiller J.E.,1989 ).

Ссылки:

Все ссылки