Селекция клеток: использование путей биосинтеза нуклеотидов
Важными моментами для понимания того, как используется биосинтез нуклеотидов для селекции являются: Основной путь синтеза пуриновых нуклеотидов ( Рис 9А ) заключается в переходе от 5'-фосфорибозил-1-альфа-D-пирофосфата (pRibpp на схеме) к инозинмонофосфату, pI, который далее превращается либо в аденозинмонофосфат, рА, либо через промежуточный ксантозинмонофосфат, рХ, в гуанозинмонофосфат, pG. Инозинмонофосфат, таким образом, является точкой разветвления метаболизма, исходным продуктом и для рА и для рG.
Существуют альтернативные пути синтеза пуриновых нуклеотидов: Инозинмонофосфат может быть синтезирован из гипоксантина (Hyp) и pRibpp, а гуанозинмонофосфат из гуанина (Gua) и pRibpp c помощью одного и того же фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы HGPRT на схеме.
Аденозинмонофосфат может быть синтезирован подобным же образом из аденина (Ade) с помощью аденозинрибозилфосфотрансферазы APRT (есть и другие пути, но здесь они не рассматриваются, поскольку они существенно менее эффективны).
Таким образом, метаболизм пуриновых нуклеотиов удовлетворяет сформулированным выше требованиям. Если, например, получить мутант по гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе и блокировать ингибитором синтез по основному пути, то мутантные клетки будут поставлены в безвыходное положение и не будут расти. Способность к росту можно восстановить, если ввести в клетки ген гипоксантингуанинтрансферазы дикиго типа. Тогда клетки приобретут способность к росту на среде с ингибитором.
Клетки мутантные по HGPRT могут быть получены от больных наследственным заболеванием - синдромом Леш-Нихана . (Больные с этим синдромом имеют повреждение на Х-хромомосоме в области гена hprt .
Больные страдают тяжелыми нервными расстройствами, в частности, склонностью к членовредительству, ( Glover,p192 , PNAS,78, 2072 - 2076, 1981). Основной путь метаболизма стандартно блокируют аналогами фолиевой кислоты - аминоптерином или аметоптерином ( метотрексатом ). Мутантные клетки неспособны расти на среде, содержащей эти ингибиторы и гипоксантин, а также тимидин, необходимый для синтеза тимидинмонофосфата.
Основной путь биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов ( Рис. 9Б ) включает в себя синтез оротовой кислоты, ее фосфорибозилирование с помощью pRibpp и фермента оротатфосфорибозилтрансферазы , и затем превращении продукта, полученного в результате, в уридин-5'-фосфат за счет декарбоксилирования. Уридин-5'-фосфат превращается в трифосфат, который затем аминируется, давая СТР.
Все дезоксирибонуклеотиды образуются за счет восстановления рибонуклозиддифосфатов одним и тем же ферментом - рибонуклезиддифосфатредуктазой . Образущиеся дифосфаты затем превращаются в трифосфаты. Тут возникает опасность, что дезоксирибоуридинтрифосфат будет включаться в ДНК. Клетка предусматривает способ избегать такие нежелательные эффекты и имеет специальный фермент, который гиролизует dUTP до монофосфата. Дезоксиуридинмонофосфат превращается в тимидинмонофосфат за счет метилирования тимидилатсинтетазой . В качестве донора метильной группы используется N5,10 -метилентетрагидрофолат.
N5,10 -метилентетрагидрофолат используется также в качестве донора углерода при образовании инозинмонофосфата. И синтез IMP и синтез pT подавляется аналогами фолиевой кислоты.
Существует альтернативный путь синтеза pT исходя из тимидина путем его фосфорилирования тимидинкиназой. Поэтому если получить клетки, дефектные по тимидинкиназе (tk- клетки), и блокировать основной путь синтеза тимидинмонофосфата аминоптерином, то такие клетки не будут расти на среде с ингибитором. Введение в их хромосому гена тимидинкиназы путем трансформации даст возможность роста таким клеткам при условии, что в среде присутствует тимидин для того, чтобы обеспечить запасной путь синтеза тимидинмонофосфата. Не забудьте, что добавив в среду аминоптерин, мы заингибировали также синтез инозинмонофосфата по основному пути. Поэтому в среду нужно добавить также гипоксантин, чтобы синтез pI мог осуществляться по запасному варианту. Таким образом, как для селекции с использованием мутантов по гену hprt, так и мутантов по tk используют одну и ту же селективную среду (НАТ) , содержащую гипоксантин (Н), аминоптерин (А) и тимидин (Т). Эта среда так и называется - НАТ. К сказанному можно добавить, что в качестве гена тимидинкиназы наиболее часто используют ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk), в качестве гена, замещающего гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу клеток животных, применяют бактериальный ген ксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (фермент HGPRT у животных ксантин не использует). Этот ген очень широко используется. Он известен, как ген gpt и мы с ним еще будем сталкиваться в дальнейшем. А у тимидинкиназы вируса простого герпеса есть замечательное свойство - она способна фосфорилировать антивирусный препарат ганцикловир , который затем включается во вновь синтезируемые нуклеиновые кислоты в клетке. В результате те клетки, которые экспрессируют этот ген, как следствие заражения вирусом простого герпеса, или в результате искуственного введения генными инженерами, гибнут, если в среде, на которой их выращивают, содержится ганцикловир.
Еще одно обстоятельство.
Микофеноловая кислота ингибирует превращение рI в рX. Животный фермент не может превращать ксантин в соответствующий монофосфат. Более подробно об этих вещах вы можете прочесть в книгах Гловера [ Гловер, 1989 , Glover ea 1989 ].
