Таргетинг: использование цис-действующих элементов таргетируемого гена
Стратегия, применяемая для селекции гомологичной рекомбинации с помощью гена neo и дающая некоторое дополнительное обогащение клонами с гомологичной рекомбинацией по сравнению с негомологичной, заключается в использовании цис-действующих элементов таргетируемого гена. В этом случае ген, осуществляющий положительную селекцию, вставляется в вектор без промотора ( Brookes A.J., ea., 1993 ; Doetschman T., ea., 1988 ; Dorin J.R., ea., 1989 ; Feldhaus A.L., ea., 1993 ; Hasty P., ea., 1993 ) или без энхансера ( Jasin M., ea., 1988 ).
Эффективная экспрессия селектирующего гена может присходить только в результате внедрения вектора в геном вблизи промоторных/энхансерных участков.
Другой вариант этого подхода - использование вектора, содержащего слитый N- концевой участок гена- мишени и лишенный сигнала начала трансляции ген neo ( Schwartzberg P.L., ea., 1990 ; Stantion B.R., ea., 1990 ). За счет использования таких модификаций достигалось более чем 100-кратное обогащение таргетинга по сравнению со случайным встраиванием вектора.
Наиболее значительное обогащение было достигнуто при инактивации 2 аллелей гена pim-1 ( te Riele H., ea., 1992 ) : от 60 до 80% колоний, устойчивых к антибиотикам, содержали ген pim-1, инактивированный в результате гомологичной рекомбинации. При "нокаутировании" гена коннексина 43 с помощью вектора замещения, содержащего беспромоторный ген neo, корректный таргеттинг происходил в каждом третьем neo- клоне ( Reaume A.G., ea., 1995 ). Однако такую стратегию можно использовать только для таргетирования генов, активно экспрессирующихся в ЭС-клетках.
Soriano ( Friedrich G., ea., 1991 ; Soriano P., 1896 ) предложил создавать векторы для гомологичной рекомбинации с использованием гибридного гена lacZ-neo(geo). С этой целью была сконструирована кассета с промотором гена pgk и сайтом полиаденилирования (PGK -geobpА), а также беспромоторная кассета - geobpA. В результате гомологичной рекомбинации с такими векторами образуется как бета-галактозидазная, так и неомицинфосотрансферазная активность. Первая позволяет выявлять экспрессию таргетированного гена с помощью хромогенного субстрата X-gal, который образует голубой преципитат при расщеплении бета-галакозидазой, кодируемой геном lacZ, а вторая обеспечивает устойчивость к антибиотику G418. В случае беспромоторной кассеты экспрессия гена geo осуществляется под влиянием цис-действующих элементов таргетированного гена. Использование векторов с -geobpA в сочетании с геном tk HSV обеспечило довольно высокую эффективность селекции гомологичной рекомбинации ( Soriano P., ea., 1991 ).
Кроме гена neo, для положительной селекции иногда используются также гены gpt ( ксантингуанинфосфорибозилтрансфераза ) ( Feldhaus A.L., ea., 1993 ; Jasin M., ea., 1988 ) и hyg ( гигромицинфосфотрансфераза ) ( Deursen van J., ea., 1992 ; Lee E.Y., ea 1992 ; te Riele H., ea., 1992 ).
Экспрессия этих генов выявляется на селективных средах с микрофенольной кислотой или гигромицином В соответственно. В некоторых экспериментах для инактивации 2 аллелей одного гена последовательно используют 2 разных положительных селективных маркера ( Feldhaus A.L., ea., 1993 ; te Riele H., ea., 1992 ). Гены, осуществляющие отрицательную селекцию, располагают на конце векторов. При гомологичной рекомбинации должна происходить делеция этих генов, а при случайном встраивании вектора они также должны встраиваться в хромосому и обеспечивать в определенных условиях гибель глеток.
Для отрицательной селекции чаще всего используют ген tk HSV. Первоначально использовали векторы, в которых ген tk содержался на одном из концов. В дальнейшем из-за высокой частоты случайного расщепления вектора при трансфекции было предложено использовать для конструирования векторов кассеты с двумя генами tk HSV ( McMahon A.P., ea., 1990 ; Thomas K.R., ea., 1990 ), которые расположены на обоих концах вектора. Частота случайных мутаций, приводящих к одновременной инактивации или потере обоих генов tk , должна быть при этом на 3 порядка ниже, чем сединичным геном tk ( Capecchi M.R., 1989 ). Такая модификация вектора, однако, не привела к существенному обогащению при селекции клонами с гомологичной рекомбинацией. В настоящее время иногда ген tk не соединяют с вектором, а осуществляют котрансформацию линеаризированного вектора замещения с кольцевой плазмидой, содержащей ген tk ( Mac Macking J.D., ea., 1995 ).
Экспрессию гена tk HSV селектируют на среде с ганцикловиром или FIAU(1-[2-деокси, 2-флюоро- В-арабинофуранозил ). В присутствии одного из этих реагентов клетки, синтезирующие тимидинциклазу, погибают. Однако при селекции с помощью ганцикловира, являющегося нуклеотидным аналогом, потенциально возможны случайные мутации в генах. Существует и проблема с выбором оптимальных концентраций реагентов, осуществляющих отрицательную селекцию.
