Рекомбинация гомологичная в клетках млекопитающих с экзогенной ДНК
Существуют 2 принципиальные возможности для гомологичной рекомбинации между экзогенной (вектор) и геномной (мишень) последовательностями ДНК: замещение и внедрение. Замещение осуществляется в результате взаимодействия колинеарной с мишенью последовательности вектора через двойной кроссинговер или генную конверсию ( рис. 1,а ). Место кроссинговера при гомологичной рекомбинации с таким вектором строго не фиксировано. Единичный кроссинговер приводит к инсерционному событию. Инсерция происходит в том случае, когда последовательности, лежащие в мишени рядом, располагаются при линеаризации вектора на его концах в инвертированной форме. При этом гомологичные последовательности вектора внедряются в мишень целиком через двунитевой разрыв, а сама мишень частично дуплицирует ( рис. 1,б ).
Экспрессия гена-мишени при помощи гомологичной рекомбинации с вектором замещения нарушается в результате замены части гена последовательностями вносимого вектора, в котором мутирована структурная область за счет инсерции в нее селектируемого гена и/или делеции. При этом происходит полное выключение гена-мишени (" нокаут ") и возникает null-мутация . При использовании для гомологичной рекомбинации вектора инсерции "нокаутирование" гена осуществляется в результате частичной внутренней дупликации с нарушением структуры 1 из 2 дуплицированных копий инсерцией селектируемого гена.
Впервые данные о возможности гомологичной рекомбинации между хромосомной ДНК млекопитающих и экзогенной ДНК, введенной в соматические клетки, были получены в 1982 г. ( Folger K.R. ea., 1982 ). Затем было обнаружено, что для осуществления гомологичной рекомбинации необходимо использовать линеаризованные векторы, а не суперскрученную плазмидную ДНК ( Thomas K.R., ea., 1986 ).
Последующие эксперименты показали, что в клетках млекопитающих гомологичная рекомбинация может быть неконсервативной и консервативной, реципрокной и нереципрокной (последняя осуществляется, по-видимому, чаще) ( Capecchi M.R., 1989 ). Геном клеток, в которых происходит гомологичная рекомбинация, как правило, не содержит дополнительных случайно интегрированных копий вектора ( Rommerskirch W., ea., 1988 ; Thomas K.R., ea., 1986 ; Thomas K.R., ea., 1986 ; Zheng H., ea., 1990 ).
Это обстоятельство оказалось весьма важным для дальнейшего использования гомологичной рекомбинации с целью таргетинга. Уже первые эксперименты по переносу генов в геном млекопитающих показали, что в отличие от дрожжей, в клетках которых преимущественно происходит гомологичная рекомбинация ( Orr-Weaver T.L., ea., 1981 ), у млекопитающих экзогенная ДНК в большинстве случаев встраивается в случайные места генома. Соотношение гомологичной рекомбинации с негомологичной варьирует в диапазоне 10-210-4, а частоты гомологичной рекомбинации для различных генов составляют от 10-3 до 10-7 ( Bollag R.J., ea., 1989 ). Причины столь значительных различий между дрожжами и млекопитающими неясны. Маловероятно, что это связано с различиями в размерах геномов, поскольку, например, не обнаружено изменений в эффективности таргеттинга амплифицированного локуса по сравнению с неамплифицированным ( Zneng H., ea., 1990 ).
Наблюдали также большие различия в частотах гомологичной рекомбинации при проведении экспериментов на разных уникальных генах млекопитающих. Существует мнение, что для некоторых генов таргетинг вообще не может быть достигнут ( Joiner A.L., 1991 ). Ни модификация вносимой ДНК ( Chang X.-B., ea., 1987 ), ни синхронизация клеток ( Wong E.A., ea., 1987 ), ни изменение количества трансфецируемой ДНК ( Rommerskirch W., ea., 1988 ) не позволили на первых порах существенно повлиять на повышение эффективности гомологичной рекомбинации. По этой причине на первом этапе были осуществлены поиск систем селекции этих редких событий и совершенствование структуры переносимой ДНК (векторов). Особое внимание привлекли к себе плюрипотентные ЭС-клетки , поскольку их использование позволяет переносить таргетинг на целые организмы.
