Таргетинг: мутирование генов in vivo

С помощью гомологичной рекомбинации можно не только осуществлять полное нарушение экспрессии генов, но и вводить в него небольшие мутации (включая точечные), а также проводить его коррекцию. В частности, в ЭС-клетках с помощью вектора инсерции, содержащего фрагмент гена дикого типа, осуществили коррекцию селектируемого мутантного гена hprt , несущего протяженную делецию ( Doetschman Th., ea ., 1987 ). При этом частота таргетинга была сходной с той, которая наблюдалась при "нокаутировании" гена hprt .

S.Thompson и соавт. ( Thompson S., ea., 1989 ) с помощью таргетинга провели коррекцию другого мутантного гена hprt (небольшая делеция 5'-концевой части гена). С этой целью был использован вектор замещения. Из ЭС-клеток с таргетированным геном удалось получить химерных мышей с геном hprt дикого типа.

Были проведены удачные эксперименты и по коррекции мутантного гена, кодирующего большую субъединицу РНК-полимеразы II . Ген содержал 2 точечные мутации, одна из которых обеспечивала резистентность к альфа-аманитину, а другая изменяла сайт рестрикции. Это позволило провести коррекцию и отбор клонов, используя вектор, содержащий только последовательность гена без селективных маркеров ( Steeg C.M., ea., 1990 ).

R.Brinster и соавт ( Brinster R.L., ea., 1989 ) осуществили коррекцию "молчащего" беспромоторного гена гистосовместимости , используя микроинъекции фрагмента гена в пронуклеусы зигот с последующим анализом большого числа трансгенных мышей. В дальнейшем для введения мутаций в любой неселектируемый ген были разработаны специальные процедуры. Двухстадийная процедура с использованием инсерционного вектора, получившая название " hit and run " ( Hasty P., ea., 1991 ; Hasty P., ea., 1993 ), изображена на рис.5,а .

На первом этапе вектор инсерции, содержащий необходимую мутацию, внедряется за счет гомологичной рекомбинации в таргетируемый локус, и соответствующие клоны отбираются с помощью позитивной селекции, Затем в результате вторичной внутрихромосомной рекомбинации между дуплицированными участками происходит делеция маркерных генов (гена), что выявляется с помощью негативной селекции. В принципе для осуществления как позитивной, так и негативной селекции может быть использован единичный ген, такой как hprt. В этом случае позитивнгая селекция осуществляется на среде HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), а негативная - на среде с 6-TG. P.Hasty и соавт. ( Hasty P., ea., 1991 ) для введения мутации в ген Hox- 2.6 с помощью процедуры "hit and run" сконструировали инсерционный вектор, в котором вне области гомологии были расположены гены neo и tk.

Такая же стратегия была использована для введения небольшой инсерции в ген hprt ( Volancius V., ea., 1991 ) и для осуществления специфических мутаций в гене Colla-1 ( Wu H., ea., 1994 ) и гене муковисцидоза ( Dorin J.R., ea., 1992 ). По мнению авторов последней работы, данный подход может быть использован для аттенуации ожидаемого фенотипа, и векторы инсерции в этом отношении более полезны, чем векторы замещения. Такое заключение сделано на основании того, что частичная дупликация, сопровождающая инсерцию вектора, создает возможность для возникновения амального сплайсинга. В результате этого происходит "пропуск" экзона и может образоваться неполный белок, который, однако, частично сохраняет свою фкнкцию.

Введение направленных мутаций возможно и на базе двух векторов замещения ( рис. 5б ). В этом случае на первой стадии осуществляют внедрение вектора с геном типа hprt за счет двойного кроссинговера, а затем селектируемый ген, вызывающий нокаутирование гена-мишени, удаляют с помощзью второго вектора замещения, содержащего желательную мутацию. Такая стратегия называется " in-out ". Хотя в настоящее время это название используется иногда и для варианта, изображенного на рис. 5а , представляется, что оно более подходит именно к варианту с двумя векторами замещения, который иногда называют еще "двойным замещением". (см. рис. 5б ). название "hit and run" больше соответствует варианту, описанному и названному так P.Hasty и соавт. ( Hasty P., ea., 1991 ), покольку напоминает механизм трансформирующего действия онкогенных ретровирусов. В дальнейшем для реализации вышеописанных схем были использованы слитые бифункциональные гены, обеспечивающие одновременно как позитивную, так и негативную селекцию: tk/neo ( Schwartz F., ea., 1991 ; Wu H., ea., 1994 ) и hyg/tk ( Lipton S.D., ea., 1991 ).

Существенным ограничением для процедур, изображенных на рис. 5 , является высокая частота, с которой маркерный ген теряется за счет механизмов, отличающихся от указанных схем ( Joiner A.L., 1991 ).

Первый этап - введение вектора в ген - по-видимому, более эффективен в процедуре "hit and run", поскольку частота гомологичной рекомбинации выше с вектором замещения, однако процедура "in-out" осуществляется значительно быстрее ( Wu H., ea., 1994 ). Кроме того, проведение первого этапа в процедуре " in-out" позволяет в дальнейшем использовать полученные клоны ЭС-клеток для одноэтапного введения в таргетированный ген любых мутаций. Таргетирующий вектор, используемый в данном случае на втором этапе, довольно прост для конструирования, поскольку содержит только мутантную геномную последовательность.

С процедурой "in-out" сходен другой вариант, получивший название " tag-and-exchahge " ( Askew G.R., ea., 1993 ). Однако H.Wu и соавт. ( Wu H., ea., 1994 ) считают его менее эффективным.

Модификацией процедуры "in-out" является использование на втором этапе вместо вектора замещения ферментативной активности дрожжевой рекомбиназы ( FLP ), которая осуществляет в клетках дрожжей специфическое вырезание фрагмента, расположенного между так называемыми мишенями для FLP. Такой вариант был впервые испытан при изучении функции регуляторного участка глобиновых генов ( Fiering S., ea., 1993 ). В данном случае в векторе, используемом на первом этапе для инсерции в регуляторный участок, с двух сторон от единичного гена neo были включены фрагменты, являющиеся мишенями для фермента. На первом этапе в результате инсерции вектора регуляции экспрессии глобиновых генов нарушалась. Для последующего удаления гена neo из мутантных клеток эти клетки трансформировали плазмидой с геном FLP. За счет действия рекомбиназы были получены клоны, в которых инсерция гена neo отсутствовала, что приводило к восстановлению нормальной экспрессии генов.

Мутировать определенный ген можно и с использованием единичного гена типа neo, внося изменения в обычно принятую схему, например, вставляя маркерный ген в интрон или 3 - нетранслируемую область генной последовательности, содержащейся в векторе. Такую стратегию выбрали, например, P.Mountford и соавт. ( Mountford P., ea., 1994 ) при изучении роли 3 -нетранслируемой области гена в стабильности мРНК-фактора ингибирования лейкемии.

С помощью гомологичной рекомбинации можно вводить в определенные локусы репортерные гены, что позволяет более адекватно, чем с помощью других подходов, следить за динамикой и локализацией экспрессии определенного гена. Так ген lacZ, расположенный в векторе в рамке считывания с геном int-2 , был вставлен в клеточный ген, что позволило проследить картину экспрессии этого гена на ранних стадиях развития эмбриона мыши ( Mansour S.L., ea 1990 ). Сходным образом P.Soriano ( Soriano P., 1986 ) исследовал экспрессию гена PDGF - , вставляя в него с помощью гомологичной рекомбинации беспромоторную кассету - geopA (см.выше). Использование репортерного гена с экзогенным промотором может искажать истинную картину (Shaw-White J.R., ea., 1993 ). По этой причине при конструировании векторов для гомологичной рекомбинации, проводимой с целью изучения экспрессии гена, иногда используют внутренний сайт инициации трансляции в рибосоме пикорнавирусов (сокращенно IRES). Обеспечивая эффективную трансляцию матрицы с внутреннего инициирующего кодона, IRES позволяет создавать дицистронные конструкты. Используя кассету IRES- - geo, можно, например, делетировать весь ген или его часть, внедряя при этом репортерный ген lacZ, или добавлять репортер к определенному гену без его модификации ( Mountford P., ea., 1994 ). При этом достигается более близкая к природной ситуация, поскольку репортер может работать без каких-либо дополнительных экзогенных элементов, контролирующих его транскрипцию. S.Fiering и соавт. ( Fiering S., ea ., 1993 ) использовали IRES для визуализации трансфекции гена FLP конструкт, состоящий из генов FLP и бета - gal , с расположенным между ними фрагментом IRES.

Иногда для введения в ген небольших мутаций или коррекции гена с помощью гомологичной рекомбинации обходятся без селектируемого маркера. В этих случаях требуется повышение частоты интеграции вектора с геном, что достигается микроинъекцией вектора в ЭС-клетки ( Zimmer A., ea., 1989 ) или прямо в зиготы ( Brinster R.L., ea., 1989 ), а для выявления таргетинга используется PCR .

Следует иметь в виду, что коррекция фенотипа может происходить не только за счет гомологичной рекомбинации с вектором, содержащим последовательности гена-мишени. Y.Aratani и соавт. ( Aratani Y., ea., 1992 ) описали такое явление, как репаративное добавление концов . При анализе ревертантов, полученных за счет электропорации в мутантные клетки гена аденинфосфорибозилтрансферазы, эти авторы обнаружили, что у части из них не происходила коррекция мутантного гена, а фенотипический эффект достигался в результате достраивания концов в таргетирующем векторе и последующей интеграции полноценного гена с геномом.

Ссылки:

Все ссылки