Таргетинг: использование PCR для выявляления гомологичной рекомбинации
В конце 90х гг в результате усовершенствования векторов, выяснения влияния различных факторов на частоту гомологичной рекомбинации и, главное, появления высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции (PCR) некоторые исследователи пошли по пути отказа от негативной селекции. Это связано также с тем, что обогащение клонами с гомологичной рекомбинацией за счет отрицательной селекции хотя и достигает в некоторых случаях 10 000 раз ( Braun T., ea., 1992 ), нередко вообще не происходит или происходит очень незначительно ( Masu Y., ea., 1993 ; Rudnicki M.A., ea., 1992 ).
Например, ( Molina T.J., ea., 1992 ) для таргетинга гена p56 использовали вектор, в котором в одном из экзонов гена p56 содержалась только кассета с геном neo (pMCneopA). При этом гомологичная рекомбинация выявлялась с помощью PCR в 1 из 130 G418- резистентных клонов ЕС-клеток.
Аналогичную стратегию использовали и A.Aiba и соавт. ( Aiba A., ea., 1994 ) при таргетинге гена mGluRI . Гомологичная рекомбинация была выявлена в 1 из 25 клонов. P.Saftig и соавт. ( Saftig P., ea., 1995 ) смогли обнаружить клоны с гомологичной рекомбинацией, используя вектор только с геном neo и последующий блот- анализ.
Таким образом, предложенные модификации векторов и новые методы детектирования позволяют в ряде случаев (а может и в большинстве, что покажут только дальнейшие эксперименты) для получения и выявления гомологичной рекомендации в принципе отказаться от методологии, отраженной в методе позитивно-негативной селекции. Незначительный вклад отрицательной селекции может быть связан с подбором удачного промотора для гена, осуществляющего положительную селекцию, и неудачным для гена, определяющего отрицательную. Это обусловлено, возможно, тем, что при случайной интеграции с молчащими местами хромосом происходит репрессия экспрессии селектируемого маркера. В любом случае использование такого эффективного метода, как PCR, позволяет при достигнутых соотношениях гомологичной рекомбинации с негомологичной выявлять первую и без предварительной негативной селекции.
В отдельных случаях исследователи, опираясь на чувствительность метода PCR, вообще отказываюттся от предварительной селекции, если эффективность переноса гена в клетки велика. В частности, A.Zimmer и P.Gruss ( Zimmer A., ea., 1989 ) для таргетирования гена hox1.1 использовали фрагмент ДНК без селективных маркеров, который вводили в ЭС-клетки с помощью микроинъекций. Наличие гомологичной рекомбинации тестировали с помощью PCR, используя для этой цели короткую вставку из 20 п.н., введенную в кодирующую область вектора для предотвращения экспрессии таргетируемого гена. В результате примерно в 1 из 150 инъецированных клеток обнаружили гомологичную рекомбинацию.
