ПЦР: проблемы, связанные с молекулярной диагностикой
Самая большая проблема полимеразной цепной реакции является прямым результатом ее способности вырабатывать большое количество продуктов ( ампликонов ). Поскольку ДНК - молекула стабильная, ампликоны могут быстро размножиться и загрязнить все поверхности в лаборатории. После этого они начнут проникать во все проводимые там ПЦР, в результате чего каждая такая реакция окажется положительной, вне зависимости от того, содержал ли образец контрольный микроорганизм или нет. В том, что ситуация именно такова, легко убедиться благодаря реакционным пробиркам, содержащим все необходимое для ПЦР, кроме ДНК. Эти чистые пробирки оставляют открытыми в течение получаса, после чего крышки закрывают и начинаются реакции. В сильно загрязненной лаборатории все реакции дадут положительные результаты, поскольку проникшие в них ампликоны идеальны для дальнейшей амплификации. Данный тип загрязнения представляет проблему лишь в том случае, если все еще используется первоначальная пара праймеров, поскольку ампликоны из одной пары праймеров не являются причиной ложноположительных результатов во всех других праймерах до тех пор, пока не сформировали общую цепочку. Загрязнение ампликонами является проблемой и для гнездных реакций, поскольку между первым и вторым циклом ПЦР пробирка зачастую остается открытой.
Некоторые меры способны уменьшить риск ложноположительных результатов. Например, саму реакцию следует проводить в одной комнате, а вскрывать пробирку для анализа полученных результатов - в другой (поскольку именно при этом происходит распространение ампликонов). Кроме того, существуют химические методы -"стерилизации" ампликонов, что позволяет нейтрализовать их способность становиться целью последующих амплификаций. Хотя бы один из этих методов должен быть указан в каждом диагностическом протоколе ПЦР. Но даже после принятия всех этих мер предосторожности важно задействовать соответствующий отрицательный контроль за каждым образцом - вроде реакции с чистыми тубами. Отрицательный контроль, который пренебрегает реверсионной транскриптазой , следует применять и для РТ-ПЦР.
В принципе, даже если риск загрязнения был по возможности исключен, при интерпретации положительных результатов ПЦР существует еще одна проблема. Определенный микроорганизм может действительно присутствовать в клиническом образце, однако находиться там в латентном состоянии, как это бывает с вирусами герпеса ( Т. gondii ) и некоторыми ретровирусами . Ложноположительные результаты могут возникать и в том случае, если ПЦР используется вместо культуры бактерий, чтобы определить реакцию на антимикробную терапию. Результат ПЦР способен оставаться положительным и после успешно проведенной терапии, поскольку это может амплифицировать микроорганизмы, которые больше не жизнеспособны, но по-прежнему содержат нуклеиновую кислоту.
Ложноотрицательные результаты ПЦР являются меньшей проблемой, однако они порой тоже случаются. Например, когда такой микроорганизм, как В. burgdorferi , все еще присутствует в нервной ткани, однако иммунная система организма способна очистить его от образца СМЖ, используемого в ПЦР. Другой пример ложноотрицательного результата - когда в образце присутствуют ПЦР-ингибиторы, то большинство ингибиторных гемов получены из гемоглобина.
