Лабораторные исследования функций нейтрофилов
Получение документальных данных о дисфункции нейтрофилов с помощью лабораторных анализов является дорогой, сложной и трудоемкой процедурой. К сожалению, для многих биологических анализов функций нейтрофилов характерны непостоянство или наследственные ограничения. Из-за этого бывает трудно обнаружить слабые нарушения функций нейтрофилов. В дальнейшем на функции нейтрофилов оказывают влияние воспаления, инфекции и лекарственные препараты. Чтобы уменьшить действие последних, желательно провести исследование функций нейтрофилов в период ремиссии заболевания и отмены препаратов. При подозрении на наличие дисфункции нейтрофилов следует сделать анализы для оценки опсонизационной активности и генерации хемотаксических факторов из сыворотки крови, а также адгезии нейтрофилов, хемотаксиса, фагоцитоза и уничтожения бактерий.
Опсонизация оценивается по концентрации иммуноглобулина (особенно IgG ) и комплемента ( СЗ ) в сыворотке крови у пациента и по анализу способности сыворотки поддерживать фагоцитоз бактерий. При концентрации IgG менее обычного желательно установить образование антигенов к Т-зависимым ( тетанус токсоид ) и Т-независимым ( Brucella abortus antigen , эритроциты, взятые у овцы) антигенам. Кроме того, предусмотрительный врач должен измерить количество иммунных комплексов в системе кровообращения для оценки катаболизма антител.
Генерацию хемотаксических факторов можно оценить подсчетом хемотаксиса контрольных нейтрофилов в сыворотке крови у пациентов, которые были "активированы" предыдущим воздействием дрожжевой инфекции ( зимозана ) или очищенного эндотоксина.
Адгезия измеряется процентами нейтрофилов у пациента, которые прилипают к столбикам из нейлоновых волокон. При наличии нарушения адгезии для оценки CD11-CD18 -экспрессии интегрина на плазменной мембране нейтрофила можно использовать методы проточной цитометрии и флуоресцентных изотиоцианатных (ИТС)-конъюгированных моноклональных антител.
Хемотаксис можно измерять in vitro по миграции нейтрофилов на агарозе или с помощью миграции мембраны поликарбоната в слепой ячейке (модифицированной камере Бойдена) при реакции на хемотаксическую составляющую. Анализ хемотаксиса in vivo можно провести путем учета миграции нейтрофилов в "кожные окна" или камеры на участках незначительных повреждений кожи. Хемоаттрактантом обычно является эндотоксин- или зимозан-активированная смешанная сыворотка доноров. В отличие от некоторых видов животных, включая человека, нейтрофилы у собак и кошек не реагируют на N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (f-MLP) , синтетический хемотаксический трипептид.
Фагоцитоз нейтрофилов можно подсчитать, используя световой микроскоп или проточную цитометрию. Нейтрофилы питаются опсонизированными флюоресцентными латексными гранулами, импрегнированными латексными гранулами тетразолиевого голубого и бактериями. Проточная цитометрия позволяет подсчитать процент фагоцитных нейтрофилов и точно установить до пяти флюоресцентных латексных гранул в клетке. Эти параметры также можно подсчитать при помощи светового микроскопа, но это более трудоемкий метод. Однако он позволяет отличить прикрепление бактерий к клеточной мембране от их действительного поглощения или фагоцитоза.
Бактерицидную активность нейтрофилов можно подсчитать прямым или косвенным путем. Косвенный анализ предположительной бактерицидной способности проводится измерением иодирования (125I) протеина по пероксидмиелопероксидазной-галогенидной реакции водорода, ослаблению окраски тетразолиевого голубого (желтого) на формазан (синюю) под действием кислородных радикалов, хемолюминесценции с люминолом, по мере того как супероксид выделяет цвет при переходе из возбужденного состояния в состояние покоя и происходит изменение цитохимической окраски или химического анализа из-за активности миелопероксидазы. Прямой анализ бактерицидной активности осуществляется путем кормления нейтрофилов опсонизированными патогенными бактериями в лаг-фазе. Число убитых бактерий обычно подсчитывается при проверки лизатов нейтрофилов на наличие жизнеспособных бактерий при высевании культуры на агаре.
