Культивирование грибов в ветеринарной дерматологии
Культивирование грибов имеет важное значение, если есть подозрение на дерматофитию , а трихография и исследование с помощью лампы Вуда дали отрицательный результат. Во избежание усиления контаминации пораженный волос зажимают на расстоянии 1 см от кожи и место поражения слегка дезинфицируют 70%-ным спиртом, а затем дают высохнуть. После этого ломкий и светящийся волос, а также чешуйки и шерсть на внешней части поражения собирают стерильными гемостатическими зажимами и помещают либо в небольшой бумажный конверт для последующей инокуляции, либо вносят сразу в питательную среду. Нужно следить за тем, чтобы как можно больше собранной пробы находилось в контакте с питательной средой, так как только из спор, соприкасающихся со средой, может развиться мицелий гриба. Для животных с отсутствием поражений (особенно у кошек с отсутствием симптомов, которые предположительно считаются переносчиками заболевания, или у животных, у которых производится последующее высевание культуры после курса лечения) желательно применять метод Мак-Кензи с использованием зубной щетки. Можно использовать новые зубные щетки в индивидуальных пакетах, поскольку благодаря их оригинальной упаковке они обычно микологически стерильны. Нужно расчесать все тело животного, в особенности участки, предрасположенные к дерматофитии, такие как область морды, ушных раковин и передних лап. Также нужно осторожно собрать небольшое количество волос с зубной щетки. Затем надо несколько раз осторожно прижимать щетку к питательной среде, после чего равномерно распределить волос и прижать его ко всей поверхности чашки Петри. Измельченные когти животного и остатки кожи, собранные кюреткой с коггевого ложа или под вогнутой передней частью коггя, также нужно исследовать на наличие грибковой культуры. Следует избегать инокуляции экссудатов и проб, недавно подвергнутых местной противогрибковой терапии. Чашки Петри и бутылки с внесенным в них материалом необходимо держать неплотно закрытыми и хранить при комнатной температуре (20-25*С) в темноте, при относительной влажности не выше 30%. Коробка из-под обуви со стаканом воды внутри может служить хорошим домашним инкубатором. Посевы следует внимательно осматривать ежедневно в течение по крайней мере 14 дней. Если по прошествии 2 недель не видно роста культуры, она считается отрицательной.
Наиболее часто применяемой средой для культивирования является питательная среда на дерматофиты (DTM). Среда содержит гентамицин и хлортетрациклин, убивающие бактерии, а также циклогексимид, задерживающий рост сапрофитных грибков. Некоторые патогенные грибки, такие как Cryptococcus , некоторые виды Aspergillus , Zymomycota и возбудители феогифомикоза чувствительны к циклогексимиду и не растут в данной питательной среде. DTM также содержит фенол красный в качестве индикатора рН, который в щелочной среде меняет желтый цвет на красный. Дерматофитные грибы вначале используют протеины в качестве питания, образуя при этом щелочные метаболиты, которые и вызывают красный цвет индикатора, как только будет замечен рост мицелия. Сапрофитные грибы потребляют углеводы, вначале образуя кислотные метаболиты, при которых цвет индикатора остается желтым. В конечном итоге при достаточно длительном выращивании культуры (10 дней и более) и обеднении данной среды углеводами сапрофитные грибы также начнут использовать протеины в качестве питания, и цвет индикатора изменится на красный. Важно отметить, что при наличии сапрофитных грибов изменение цвета среды произойдет после того, как разовьется мицелий и будет ясно видимой в течение нескольких дней. Поэтому нужно ежедневно следить за ростом культуры, высеянной на наличие грибковой микрофлоры, и изменением цвета индикатора. Поскольку другие грибы, такие как Blastomyces, Sporothrix, Histo- plasma, Coccidioides, и некоторые виды Aspergillus также быстро придают DTM среде красный цвет, необходимо произвести макроскопическое и микроскопическое исследование культуры для определения видовой специфичности грибов. Макроскопическое исследование верхней и нижней поверхности части культуры лучше всего производить при инокуляции пробы или при взятии параллельных проб от субкультуры на агар Сабуро и на агар с DTM. Microsporum canis дает ватообразную колонию беловатого цвета с желтовато-оранжевым центром в нижней части. Microsporum gypseum дает плоскую светло- коричневую колонию с гранулярной поверхностью и бледно- желтой нижней частью.
Микроскопическое исследование макроконидий лучше всего производить не ранее чем через 5-7 дней после первого наблюдения роста мицелия, желательно на среде Сабуро. В продаже представлены среды с быстрым спорулированием, но их преимущества вызывают сомнение. Кусок чистой ацетатной ленты осторожно прижимают к поверхности колонии так, чтобы ее часть прилипла к ленте. Ленту кладут на каплю коттона синего лактофенола клейкой стороной вниз на предметное стекло микроскопа и исследуют под микроскопом при 10- и 40-кратном увеличении. У макроконидий Macrosporum canis форма веретена с толстыми стенками из шести и более клеток и шишкообразные окончания. У Microsporum gypseum макроконидии в форме веретена с тонкими стенками, без шишкообразных окончаний и шесть или менее клеток. Макроконидии Т. mentagrophytes обнаружить трудно, они имеют форму сигары и тонкие стенки. Trichophyton mentagrophytes лучше всего выявляется по спиральным гифам и микроконидиям в форме винограда, которых всегда много и их легко увидеть.
