Введение мутантных генов в штаммы
Если мутации рецессивны, то репципиент должен нести инактивированную (например в результате крупной делеции или вставки) копию гена. Если такая инактивация не ведет к летальности, то ввести мутантную аллель просто. Если же исследуют жизненно важный ген, то с помощью специальной системы (так называемой "смены плазмид") отбирают мутации температурочувствительности. В качестве реципиента отбирают штамм с инактивированной копией гена, дефект которой компенсирован геном дикого типа на плазмиде. У трансформантов мутагенизированной плазмидой селектируют потери гена дикого типа или инактивируют его. В результате появляется мутантная аллель ( Shortle et al., 1984 ; Kang et al., 1990 ). Плазмиды с доминантными мутациями (например, повышение эффективности экспрессии гена) отбирают в реципиентах дикого типа ( Guarente et al., 1984 ).
При необходимости проводят замены аллелей в хромосомах - для снижения копийности мутантного аллеля, исследования его функции в хромосомном окружении. При трансформации плазмидой, линеаризованной в области гена, возможна ее интеграция или конверсия из плазмиды в хромосому или наоборот. При интеграции замена происходит в два этапа: вначале в хромосоме оказывается рецессивная мутантная и доминантная аллель дикого типа, затем проводят неселективный отбор рекомбинантов мутантного фенотипа ( Johnston et al., 1988 ; Sherer, Davis, 1979 ). Mожно трансформировать реципиент геном с точковой мутацией и делецией. В хромосоме оказываются две копии гена - одна неактивная (укороченная), а другая - с мутацией ( Shortle et al., 1982 ). В некоторых случаях возможна селекция конверсии с плазмиды в хромосому ( Struhl, 1983 ).
