Методики трансформации

В первых экспериментах трансформировали сферопласты. Проникновение ДНК стимулировали ионами кальция в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ) ( Hinnen et al., 1978 ). В дальнейшем была предложена методика трансформации интактных клеток, стимулируемой солями лития в присутствии ПЭГ ( Ito et al., 1983 .

Сферопластная трансформация высокоэффективна (до 10000-100000 трансформантов на 1 мкг ДНК) ( Struhl et al., 1976 ). К ее недостаткам относятся трудоемкость, вероятность попадания в клетку нескольких плазмид, полиплоидизация трансформантов за счет слияния сферопластов ( Hicks et al., 1979a , Karpova et al., 1984 ). Сферопласты регенерируют в толще агара, поэтому их нельзя сразу же печатать на селективные среды, - необходимо их предварительно отсеять, и это замедляет работу. Поэтому сферопластную трансформацию используют при клонировании генов и во всех тех случаях, когда нужна высокая эффективнось. Для других исследований предпочтительнее литиевая трансформация (1000-10000 трансформантов на 1 мкг ДНК). Для оптимизации часто необходимо использовать клетки, выращенные в жидкой среде и находящиеся на стадии логарифмического роста культуры. Возможна трансформация колоний, выросших на плотной среде. В этом случае получают до 1000 трансформантов на 1 мкг ДНК ( Keszenman-Pereyra, Hieda, 1988 ).

Разработаны методики, использующие физические способы стимуляции проникновения ДНК в клетку: электропорация, биолистическая трансформация. Их эффективность сравнима с литиевой. В первом случае на клетку воздействуют короткими затухающими электрическими импульсами (можно получить до 500 трансформантов на 1 мкг ДНК ( Hadwiger et al., 1989 ; Rech et al., 1989 ). Во втором - ДНК вводят в клетку на вольфрамовых шариках-носителях диаметром 1,1 мкм, которыми выстреливают в клетки в вакуумной камере. В клетку попадает 10-20 активных молекул. Бесспорное преимущество этой методики - возможность трансформации митохондрий (с частотой в 1000 раз меньшей, чем при трансформации ядра) ( Fox et al., 1988 ; Johnston et al., 1988 ). Самый простой способ - обработка смеси ДНК, клеток и стеклянных шариков на вибраторе в течение 30 сек. Выживаемость при этом менее 20%, а эффективность - около 80 трансформантов на 1 мкг ДНК. Авторы предполагают, что этот процесс может происходить в природе ( Fox et al., 1988 ).

Обнаружено также, что конъюгативные плазмиды E. coli могут мобилизовать трансмиссию векторов на основе вектора pBR322 из E.coli в Saccharomyces cerevisiae - c частотой до 1/5х100000 трансформантов на клетку дрожжей. Для сравнения - при сферопластной трансформации частота до 1/10000 трансформантов на регенерировавший сферопласт ( Hinnen et al., 1978 ).

Ссылки: