Картирование методом фрагментации
Во всех рассмотренных методиках картирования определяли порядок генов в группах сцепления. С помощью пульс-фореза можно физически картировать гены - выявить их положение по отношению к концам хромосомы, принадлежность к определенной хромосоме. Существуют различные модификации пульс-фореза ( Carle, Olson, 1985 ; Chu et al., 1986 ; Lai et al., 1989 ; McCuskey et al., 1990 ; Schwartz, Sadowski, 1989 ). При этого метода заключается в том, что электрическое поле меняет направление через определенные промежутки времени. Хромосомы при этом двигаются зигзагами и разделяются по длине. Для выделения неповрежденных крупных фрагментов ДНК (хромосом) необходим мягкий лизис клеток, и его проводят в лунках геля. Локализация проклонированных генов в определенных хромосомах осуществляется с помощью блот-гибридизации электрофоретического кариотипа с исследуемым геном.
Для точного определения положения гена в хромосоме используется методика фрагментации ( Vollrath et al., 1988 ). Была сконструирована пара плазмид: YCF3 и YCF4 , содержащих селективные маркеры и дрожжевой теломер . В YCF4, кроме того, встроен центромер . Клонируемый фрагмент встраивают в полилинкер, находящийся рядом с теломером. Перед трансформацией плазмиды линеаризуют в области полилинкера, так, чтобы на одном конце оказался картируемый ген, а на другом - теломер. При определенной ориентации проклонированного гена в плазмиде рекомбинация с гомологичной последовательностью в хромосоме приводит к образованию укороченных хромосом. Одна из них (продукт рекомбинации YCF3) содержит последовательность проксимальнее гена, другая - (продукт рекомбинации YCF4) центромер плазмиды и область дистальнее гена. При другой ориентации появятся нестабильные дицентромерные хромосомы и ацентрические фрагменты, и трансформанты выявить не удастся. Обязательно используют диплоидные штаммы, чтобы нормальная хромосома компенсировала дефект фрагментированной. С помощью пульс-фореза можно оценить размер полученных фрагментов.
Так было определено расстояние от концов хромосомы II до генов LYS2 и MEL1 . После трансформации плазмидами с LYS2 хромосома II разделилась на дистальный (475 т.п.н.) и проксимальный ( 365 т.п.н. ) фрагменты. По данным генетического картирования LYS2 находится в правом плече, это означает, что LYS2 находится на расстоянии в 460 т.п.н. от правого теломера (размер векторной последовательности 15 т.п.н.). Трансформация плазмидами с MEL1 привела к образованию дистального фрагмента в 40 т.п.н. Ранее этот ген не был картирован, и неизвестно, в каком плече он находится. Для того, чтобы это выяснить, фрагментировали хромосому по гену GAL1 (правое плечо). С фрагментами гибридизовали MEL1. Оказалось, что MEL1 гибридизуется с фрагментом, содержащим левое плечо хромосомы II.
В другом методе определения расстояния гена от конца хромосомы фрагментация хромосомы под действием Х-лучей, происходящая случайным образом, приводит к образованию широких ("размазанных") полос при пульс-форезе. При использовании в качестве пробы картируемого гена, сцепленного с данной хромосомой, гибридизация происходит только с фрагментами, содержащими данный ген. При подборе таких условий, когда на хромосому в среднем приходится один разрыв, размеры наименьшего фрагмента, с которым происходит гибридизация, соответствуют расстоянию этого гена от ближайшего конца хромосомы ( Game et al., 1990 ).
