Центромеры дрожжей

Первый дрожжевой центромер (CEN) был отклонирован методом прогулки по хромосоме ( Clarke, Carbon, 1980 ). В дальнейшем придумали более простой способ клонирования. При включении центромера в плазмиду увеличивается ее стабильность. Если в неселективных условиях плазмиды с ARS-элементами почти полностью утрачивается через 20 поколений, плазмиды, содержащие кроме того центромер CEN3, сохраняются в 90% клеток. Поэтому трансформанты инкубировали в неселективных условиях, обогащая культуру стабильными трансформантами, а затем отбирали клоны, сохранившие плазмиду. Клоны, содержащие плазмиду с центромером CEN идентифицировали по способности приводить к упорядоченной сегрегации плазмиды в мейозе и снижению ее копийности (центромер-содержащие плазмиды находятся преимущественно в виде одной копии, в результате в мейозе наблюдают сегрегацию 2+:2- по плазмидному маркеру). Сейчас проклонировано 14 центромеров дрожжей ( Mann, Davis, 1986 ; Hieter et al., 1985 ; Neitz, Carbon, 1985 ; Toh-e, Shimauchi, 1986 ; Panzeri, Philippsen, 1982 ; Fitzgerald-Hayes et al., 1982 ).

В области центромера выявлена специфическая структура хроматина. Центромерные районы в хромосоме фланкированы полутора десятками нуклеосом с расстоянием между их центрами 150-190 п.н. Эта упорядоченная организация хроматина сохраняется и при встройке центромерной области в автономно реплицирующуюся плазмиду ( Bloom, Carbon, 1982 ). Для функции центромера на плазмиде достаточен фрагмент размером в 125 п.н., что сравнимо с длиной нуклеосомного повтора - 140 п.н. ( Cottarel et al., 1989 ).

Центромерная ДНК ассоциирована с белками и образует кинетохор, к которому прикрепляются микротрубочки. Размеры ДНК, участвующей в образовании кинетохора, определяют, выявляя участки ДНК, защищенные от действия нуклеаз. Показано, что область, защищенная от действия микрококковой нуклеазы в центромере составляет 250 п.н. ( Bloom, Carbon, 1982 ). Авторы заключили, что кинетохор дрожжей - это крупное образование, отличное от обычной нуклеосомы. В настоящее время ряд авторов предполагают, что в области кинетохора все-таки находится нуклеосома ( Bloom et al., 1989 ; Funk et al., 1989 ). Когда изолировали ядра S.cerevisiae и инкубировали их с рестрикционными нуклеазами, оказалось, что из 21 рестрикционного сайта вблизи CEN14 только 5 доступны в этих условиях для рестриктаз. Район, недоступный действию рестриктаз, занимает 160 п.н. - что сравнимо с обычной длиной нуклеосомного повтора ( Funk et al., 1989 ). Это противоречит данным, полученным под действием микрококковой нуклеазы - видимо, этот метод более тонкий и чувствительный. Следовательно, размеры района ДНК, защищенного белками, совпадают с размерами минимального участка, необходимого для функции центромера.

Центромер-содержащие плазмиды , подобно хромосомам, сегрегируют упорядоченно. Наблюдается отхождение к одному из полюсов в мейозе и расщеплении 2+:2- по плазмидному маркеру. В митозе хроматиды такой минихромосомы расходятся к разным полюсам. Нарушение функции центромера сразу же нарушает упорядоченную сегрегацию. Это было использовано для исследования влияния на функцию центромера точковых мутаций и делеций, сконструированных in vitro ( Gaudet, Fitzgerald-Hayes, 1987 ; Hegemann et al., 1988 ; Cumberledge, Carbon, 1987 ; Ng, Carbon, 1987 ; McGrew et al., 1986 ; Panzeri et al., 1985 ).

Таким образом были выявлены три элемента, существенные для функции центромера. Сравнение нуклеотидных последовательностей различных центромеров позволило вывести обобщенные нуклеотидные последовательности.

Элемент II (CDEII) имеет размер около 90 п.н., он богат AТ-нуклеотидами и специфичен для каждого центромера, в то время, как элементы I, III (CDEI, CDEIII) практически полностью гомологичны у всех центромеров, их размер 10-25 п.н. ( Fitzgerald-Hayes et al., 1982 ). По краям от участков I и III находятся уникальные для каждого центромера последовательности различной длины (до нескольких сотен н.п.).

Делеция элемента CDEII приводит к полному подавлению функций центромера. Делеции, изменяющие размер элемента CDEII, приводят к нарушению его функции. Функцию элемента CDEII можно восстановить, встроив АТ-богатый фрагмент нужной длины. Нуклеотидная последовательность этого фрагмента несущественна ( Fitzgerald-Hayes et al., 1982 ).

Предполагается, что упаковка ДНК в области центромера такова, что элементы CDEI и CDEIII оказываются сближены . Вероятно, поэтому важен размер разделяющего их элемента CDEII. Например, при увеличении размера элемента CDEII в два раза сохраняются функции центромера, а увеличение его размера более или менее чем в два раза приводит к полному нарушению функций центромера.

Мутации в элементе CDEI слабо влияют на митотическую сегрегацию, но приводят к нарушениям мейоза I: видимо, происходит преждевременная сегрегация сестринских хроматид. Преждевременное деление центромеров в митозе не должно быть столь существенно для правильной сегрегации, как в мейозе. Видимо, поэтому в митозе делеции мутации элемента CDEI почти не проявляются.

В элементах CDEI и CDEII содержатся палиндромные последовательности. Центромеры не являются специфичными - могут действовать в любой хромосоме и на плазмиде в любой ориентации ( Clarke, Carbon, 1983 ).

Вблизи центромеров дрожжей находятся активно транскрибируемые участки - в отличие от центромеров высших эукариот, которые окружены гетерохроматином ( Mann, Davis, 1986 ; Steensma et al., 1987 ; Yeh et al., 1986 ; Stinchkomb et al., 1982 ).

Транскрипция центромерного участка вызывает нарушение его функции. Это показали, присоединяя CEN3 к промотору гена GAL1 . Транскрипцию с этого промотора индуцирует наличие галактозы в среде. На галактозе наблюдали нарушение функции центромера. Авторы не зарегистрировали при этом изменения структуры хроматина в области центромера, но, возможно, используемые методы недостаточно чувствительны ( Hill, Bloom, 1987 ).

Интересно, что в клетке может содержаться лишь ограниченное количество центромеров.

Центромерсодержащие плазмиды представлены в клетке одной копией, иногда двумя. Дальнейшее увеличение копийности неблагоприятно для клетки. Это показали, получая трансформанты сразу пятью центромер-содержащими плазмидами. Оказалось, что в среднем популяция клеток содержат не более трех типов плазмид. В популяции наблюдается летальность, нарушения клеточных делений ( Futcher, Carbon, 1986 ). Получены мутанты, у которых возможно накопление центромер-содержащих плазмид ( Tshumper, Carbon, 1987 ).

В настоящее время проклонированы центромеры Sch.pombe. Они значительно крупнее центромеров S.cerevisiae ( Fishel et al., 1988 ) и содержат несколько типов повторяющихся последовательностей. В этом отношении центромеры Sch.pombe сходны с центромерами высших эукариот. У Sch.pombe удалось сконструировать линейные минихромосомы ( Hannenberger et al., 1989 ).

Таким образом, центромеры сахаромицетов пока уникальны: они обладают небольшими размерами, к дрожжевому кинетохору крепится только одна микротрубочка веретена. Высказано предположение, что простое устройство центромеров сахаромицетов связано с тем, что их хромосомы слабо конденсированы и ассоциированы с веретеном деления на протяжении почти всего клеточного цикла . Поэтому нет необходимости в формировании каких-то особых структур, позволяющих микротрубочкам распознавать кинетохор.

Крупные кинетохоры необходимы тем объектам, у которых митотическое веретено формируется непосредственно перед делением, в тот момент, когда хромосомы сильно конденсированы, и распознавание небольшого кинетохора было бы затруднительно ( Clarke, 1990 ).

Ссылки:

Все ссылки