Структура хроматина у дрожжей
По современным представлениям в хромосомах высших эукариот существуют 5 уровней упаковки ДНК. Первый - нуклеосомы , октамеры, содержащие по две молекулы гистонов H2A , H2B , H3 и H4 . Гистон H1 способствует упаковке нуклеосом в соленоид-нить толщиной 30 н.м. Третий уровень - укладка соленоида в виде петель, или домена , которые удерживаются в основании белками ядерного матрикса . Детали четвертого и пятого уровней пока неясны. Предполагается, что из доменных петель формируются розетки и укладываются в спираль.
У дрожжей исследована в основном нуклеосомная организация. Показано наличие гистонов H2A, H2B, H3 и H4, но не H1. Гены для гистонов H2A, H2B, H3 и H4 клонированы ( Smith, Andersson, 1983 ; Hereford et al., 1979 ). H4 дрожжей по аминокислотному составу близок к гистонам крупного рогатого скота и бобов, но другие значительно отличаются от гистонов высших эукариот, особенно H3. тем не менее, возможность взаимодействия гистонов H2A и H2B дрожжей и крупного рогатого скота свидетельствует о консервативности областей контакта ( Weils, McBride, 1989 ).
Общая длина нуклеосомного повтора дрожжей 160-170 п.н., на поверхности находится около 140 п.н. Размер линкерной ДНК у дрожжей - 20 п.н., в среднем меньше, чем у высших эукариот.
У эукариот показано, что нуклеосомы могут быть фазированы - расположены строго упорядоченно на определенных участках ДНК. У дрожжей фазирование отмечено в области центромеров ( Bloom, Carbon, 1982 ), ARS-элементов ( Walker et al., 1989 ) и промоторов PHO5 ( Almer, Horz, 1986 ; Almer et al., 1986 ), SUC2 ( Perez-Ortin et al., 1987 ), LEU2 ( Martinez-Garcia et al., 1989 ) и других генов, причем один тип фазирования, как правило, характерен и для хромосомных, и для плазмидных генов. Плазмиды легче выделять и анализировать, поэтому в основном теперь изучают фазирование нуклеосом на плазмидных копиях гена.
В опытах in vitro встраивали различные последовательности в минихромосому ARS TRP1 и определяли, как это сказывается на количестве и распределении нуклеосом. Оказадось, что в минихромосоме есть фиксированные участки для нуклеосом. Инсерция в плазмиду фрагментов различной длины приводила либо к увеличению промежутка между нуклеосомами, либо, если инсерция была достаточно велика, к появлению новой нуклеосомы ( Thoma, 1986 ; Thoma, Simpson, 1985 ).
Фиксированные участки не являются специфически эукариотическими последовательностями. Показано, что возможна сборка нуклеосом и на прокариотических последовательностях, если их вводят на плазмидах в клетку дрожжей. При этом на pBR322 сборка происходит случайным образом, на транспозоне Tn903 расположение нуклеосом в области инвертированных повторов упорядоченно ( Estruch et al., 1989b ; Estruch et al., 1989a ).
Предполагают, что фазирование может быть связано с некими барьерами - участками, на которых невозможно образование нуклеосомы, - либо в силу структурных особенностей самой ДНК, либо из-за связывания этих участков с белками-регуляторами. Такие барьеры должны представлять собой свободные от белков зоны. Если в плазмиду встраивали фрагменты с сайтами, сверхчувствительными к действию нуклеаз, это приводило к изменению распределения нуклеосом ( Thoma, Zatchei, 1988 ).
В плазмиде также нарушали упорядоченное распределение с помощью инсерции, а затем встраивали в инсерцию сайт связывания репрессора MATalfa2p . В клетках a/alfa и alfa, но не a (в них MATalfa2 не экспрессируется) распределение восстанавливалось ( Roth et al., 1990 ).
Пробовали встраивать в область фазированных нуклеосом фрагмент URA3, для которого также в норме характерно фазирование. Если бы расположение нуклеосом зависело только от нуклеотидных последовательностей, следовало ожидать, что оно не изменится, но локализация нуклеосом менялась. Авторы предположили, что на распределение нуклеосом влияет также наднуклеосомная структура ДНК ( Thoma, Zatchei, 1988 ). Разработан метод очистки хроматина, пригодный для исследования наднуклеосомной структуры. Как оказалось, характер упаковки в 30 нм - фибриллы у дрожжей и у высших эукариот очень сходен. Вероятно, у дрожжей должен быть белок, выполняющий функцию гистона H1 ( Lowary, Widom, 1989 ).
При исследовании уровня доменной организации из генома дрожжей выделили последовательности SAR (scaffold attached regions) структурно и функционально гомологичные SAR дрозофилы и содержащие ARS-элементы, а также белки, которые связываются с SAR дрожжей: это RAP1 и ACBF .
Показана возможность образования петель хроматина in vitro при добавлении белка ядерного матрикса ( Hoffmann et al., 1989 ; Amati, Gasser, 1988 ; Amati, Gasser, 1990 ).
Другие уровни упаковки хроматина у дрожжей не исследованы. Возможно, будут выявлены различия в упоковке хроматина у дрожжей и высших эукариот в связи с тем, что хромосомы дрожжей слабо конденсируются и активно транскрибируются.
