Хромосомные репликаторы (ARS)
Первые из предполагаемых областей начала репликации (ARS) были выделены из хромосом дрожжей в 1979-80 гг. ( Stinchcomb et al., 1979 ; Hsiao, Carbon, 1979 ; Chan, Tye, 1980 ). В этих экспериментах исходная химерная плазмида не обладала способностью автономно реплицироваться в клетках дрожжей. На основе такой плазмиды конструировали банк хромосомных последовательностей, которым трансформировали штамм-реципиент. При включении хромосомного репликатора плазмида приобретала способность к автономной репликации в клетках дрожжей. В настоящее время выделено несколько десятков последовательностей ДНК, обладающих свойствами репликаторов (так называемых ARS-элементов) ( Beach et al., 1980 ; Kearsey, 1983 ; Tshumper, Carbon, 1982 ; Chan, Tye, 1983a ; Broach et al., 1984 ).
Предполагали, что ARS-элементы выполняют функцию репликаторов и в хромосоме. И действительно, было показано, что ряд ARS-элементов являются репликаторами как на плазмиде, так и в хромосоме ( Brand et al., 1987 ; Huberman et al., 1987 ; Linskens, Huberman, 1988 ). С помощью двумерного гель-электрофореза была также показана инициация репликации в области ARS-элементов ( Brewer, Fangman, 1987 ; Huberman et al., 1987 ).
Определена нуклеотидная последовательность многих ARS-элементов дрожжей и выведена обобщенная последовательность 5'(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)3', так называемый кор или домен A (ARS консенсус) ( Broach et al., 1984 ; Kearsey, 1983 ).
Точковые мутации в области кора ARS-элементов полностью нарушают его функцию - это можно выяснить по падению стабильности плазмид с мутацией ( Celnicker et al., 1984 ; Srienc et al., 1985 ; Bouton, Smith, 1986 ; Palzkill, Newlon, 1988 ).
Наличие кор-последовательности способно обеспечить автономную репликацию плазмид. Многие фрагменты эукариотической или прокариотической ДНК способны обеспечить автономную репликацию в дрожжах, хотя при этом не являются репликаторами in situ. Так, например, показана репликация в дрожжах плазмиды рС194 из Staphylococcus aureus. Однако, последовательность, отвечающая за репликацию этой плазмиды в дрожжах, не является репликатором в клетках стофилококка. Во всех этих случаях присутствует кор-последовательность.
Показано, что у плазмид с мутантным ARS-элементом очень легко восстанавливается способность к репликации. Это восстановление происходит за счет возникновения точковых мутаций или небольших дупликаций в области векторной последовательности (фаг М13), приводящих к возникновению новой кор-последовательности( Kipling, Kearsey, 1990 ).
Подобного рода эксперименты показывают, что в клетке всегда имеются последовательности, которые являются потенциальными низкоэффективными репликаторами.
И тем не менее, для функции настоящих хромосомных репликаторов одной кор-последовательности недостаточно. Во-первых, отмечены случаи, когда при наличии кор-последовательности тем не менее плазмида не способна к автономной репликации ( Palzkill, Newlon, 1988 ; Celnicker et al., 1984 ). При встройке в плазмиду короткого фрагмента с кор-последовательностью его функция сильно зависит от контекста - окружающей его векторной последовательности ( Newlon, 1988 ). Во-вторых, показано, что в ARS-элементах функция кор-последовательности сильно зависит от фланкирующих областей.
На 3'-конце кор-последовательности в ARS-элементах имеется богатый AТ-район (16-100 п.н.), который модулирует действие кора (домен В). Мелкие делеции и инсерции в этом районе несущественны, но крупные делеции полностью нарушают функцию ARS-элементов, или снижают эффективность репликации ( Celnicker et al., 1984 ; Kearsey, 1984 ; Srienc et al., 1985 ; Bouton, Smith, 1986 ). Этот домен должен обязательно находиться в 3' положении от кора, в 5' положении он не работает ( Holmes, Smith, 1989 ). Показано, что в пределах домена B находится несколько копий последовательностей, сходных с кором ( Palzkill, Newlon, 1988 ). Для репликатора гена гистона Н4 было показано, что мутации в домене В не нарушают функцию ARS-элементов ( Holmes, Smith, 1989 ). В этом же домене есть сайт связывания с белком ядерного матрикса ABF1 , который является также транскрипционным активатором ( Amati, Gasser, 1988 ). Сайты связывания белка АВF1 могут влиять на функцию ARS-элементов, находясь от него на расстоянии 1 т.п.н..
Как предполагают, функция A и В доменов в ARS-элементе аналогична таковым у доменов в ориджина репликации Е.coli .
Кор-последовательность может обеспечивать связывание специфических белков инициации репликации и является сайтом, в котором происходит расплетание ДНК, необходимое для элонгации репликации. Показано, что в клетке кор-последовательность действительно связана с некими белками ( Lohr, Torchia, 1988 ). Кор-последовательность богата АТ-нуклеотидами и, следовательно, характеризуется низкой энергией расплетания.
По поводу функции домена В высказано две гипотезы: облегчение расплетания ДНК или облегчение присоединения инициирующего комплекса. Показано, что область домена В в определенных условиях чувствительна к действию однонитиевых нуклеаз. Появление чувствительности к однонитиевым нуклеазам коррелировано с индукцией репликации ARS-элемента гена гистона Н4 ( Umek, Kowalski, 1988 ).
Область домена В может принимать " изогнутую " конформацию ( Williams et al., 1988 ). Подобная конформация наблюдается в ориджинах репликации прокариот. Предположительно, изогнутая конформация облегчает присоединение белка-инициатора репликации.
Кроме домена В, в регуляции функции некоторых ARS-элементов играет роль домен С, расположенный на 5'- конце кор- последовательности ( Celnicker et al., 1984 ; Strich et al., 1986 ; Koshland et al., 1985 ; Palzkill, Newlon, 1988 ). Этот домен играет разную роль у разных ARS-элементов. Делеции и инсерции в области домена С понижает стабильность плазмид с элементом ARS1 - на фоне частичной делеции домена В. У репликатора ARS-элемента C2G1 эффективность, наоборот, повышается при делеции домена С. Домен С обеспечивает упорядоченную сегрегацию плазмид с ARS-элементом сайленсера HMRE
Таким образом, влияние областей, расположенных с 5'-конца от кора, весьма разнообразно, поэтому, возможно, в ARS-элементах не следует выделять некий инвариантный домен С. Скорее всего, просто ряд последовательностей, оказавшихся на 5'-конце ARS-элементов, могут модулировать его функцию.
В настоящее время наличие последовательностей, выполняющих функции ориджинов, показано у других эукариот: тетрахимены, слизевиков, дрозофилы, ксенопуса, китайского хомячка и др. ( Diffley, Stillman, 1990 ; Umek et al., 1989 ). Их структурные особенности не вполне ясны. Показано, что последовательность из клеток HeLa, сходная по первичной и доменной структуре с дрожжевыми ARS-элементами и выполняющая функции репликатора в дрожжевых клетках, у человека является областью прикрепления хромосом 1 и 2 к ядерному матриксу ( Valenzuela, 1990 ).
