Зависимость стабильности хромосом от их размера
Частота потерь природных хромосом , по-видимому, зависит от генотипического фона и от конкретной хромосомы. Спонтанная частота потерь хромосом у диплоидов составляет менее 1/1000000, а у дисомиков - 1/10000 на клетку (16,12,6), причем наименее стабильны дисомики по хромосомам I , хромосомам VI , хромосомам VII , хромосомам XV , а наиболее стабильны дисомики по хромосомам III , хромосомам IV , хромосомам XI , хромосомам XII , хромосомам XIII ( Campbell et al., 1981 ).
Частота потерь искусственных хромосом составляет 1/100-1/1000 на клетку, то есть значительно больше, чем природных ( Hieter et al., 1985 ; Murray, Szostak, 1983 ). Потери связаны в основном с нерасхождением: в индивидуальных клеточных делениях сегрегация типа 2:0 (нерасхождение) происходит в пять раз чаще, чем 1:0 (потери) ( Hieter et al., 1985 ). Копийность минихромосом также высока (до 10-50 копий на клетку) ( Murray, Szostak, 1983 ; Dani, Zakian, 1989 ). И высокая копийность, и высокая частота нерасхождения свидетельствуют о том, что у минихромосом в большинстве случаев происходит неупорядоченная сегрегация.
Различия между природными хромосомами и минихромосомами сводятся к разным размерам и количеству ARS-элементов . Длина природных хромосом - от 240 т.п.н. до 2400 т.п.н., а искусственных - от 6,9 т.п.н. до 137 т.п.н. ( Dani, Zakian, 1989 ; Murray, Szostak, 1983 ; Hieter et al., 1985 ; McCarroll, Fangman, 1988 ). Таким образом, сконструированные хромосомы меньше самой маленькой из природных. В минихромосомах содержится 1-3 ARS-элемента, в то время, как в природных их должно быть не меньше семи (исходя из сопоставления размеров хромосомы и репликона). Следовательно, стоит проверить влияние этих факторов на сегрегацию ( Murray, Szostak, 1985 ; Murray, Szostak, 1983 ).
Влияние размеров на стабильность исследовали, варьируя размеры минихромосом и природных хромосом за счет вставок и делеций ( Zakian et al., 1986 ; Murray, Szostak, 1986 ; Murray et al., 1986 ; Hieter et al., 1985 ). Как оказалось, минихромосомы длиной менее 100 т.п.н. нестабильны ( Zakian et al., 1986 ), но по мере увеличения размеров стабильность растет ( Hieter et al., 1985 ; Mann, Davis, 1983 ), причем порог в этих экспериментах не был достигнут. При исследовании природной хромосомы III с делециями оказалось, что как только длина хромосомы становится меньше 100т.п.н., происходит резкое уменьшение стабильности. Видимо, для увеличения стабильности не нужны какие-либо дополнительные элементы, кроме центромеров , теломеров и ARS-элементов. Важно именно увеличение размера, так как встройка даже чужеродной ДНК - фага lambda, ведет к повышению стабильности ( Hieter et al., 1985 ). Предложено два объяснения этого набдюдения. Во-первых, предполагается, что для контакта с микротрубочками веретена центромер и теломеры должны быть связаны с определенными участками ядерного матрикса. Связь нарушится, если это расстояние окажется больше расстояния между центромерами и теломерами в минихромосоме ( Murray, Szostak, 1985 ).
Показано, что телоцентрическая хромосома большого размера стабильнее, чем малого, хотя расстояние между центромером и одним из теломеров у них равны ( Zаkian et al., 1986 ). Но окончательно эти данные опровергнуть гипотезу не могут - возможно, для правильного прикрепления центромера к матриксу достаточно, чтобы только между одним из теломеров и центромером было достаточное расстояние. Во-вторых, для стабильного прикрепления к нитям митотического веретена, вероятно, необходима тесная ассоциация между сестринскими хроматидами, которая возникает в ходе репликации, когда дочерние молекулы ДНК перекручиваются. В небольших молекулах ДНК вероятность образования катенанов меньше, поэтому сестринские хроматиды минихромосом должны чаще диссоциировать, что снижает эффективность работы веретена ( Murray, Szostak, 1985 ).
В пользу второй гипотезы свидетельствует наблюдение, что прикрепление центромеров к нитям веретена стабильно только при наличии механического напряжения, возникающего из-за связанности сестринских хроматид.
На стадии G2 сестринские хроматиды кольцевой минихромосомы не образуют катенанов, но сегрегируют нормально ( Koshland, Hartwell, 1987 ). Впоследствии показали, что сестринские хроматиды природных хромосом действительно переплетены, и их разъединение под действием топоизомеразы II происходит именно во время мейотической сегрегации . Авторы предполагают, что отличие их результатов от вышеупомянутых данных связано с исследованием линейных, а не кольцевых молекул ( Holm et al., 1989 ).
Оказалось, что значения стабильности линейных минихромосом и укороченных природных хромосом при одинаковом размере различаются на порядок. Это аргумент в пользу роли ARS- элементов в упорядоченной передаче хромосом. Потери линейных минихромосом происходят из-за недорепликации (расхождение 1:0), а укороченных природных - за счет нерасхождения (2:0) ( Murray et al., 1986 ; Hieter et al., 1985 ), то есть уменьшение стабильности может быть связано и с неэффективной репликацией . Возможно также, что множественность репликонов способствует перекручиванию сестринских хроматид и осложняет преждевременную сегрегацию.
