Теломеры дрожжей
Из эукариотических теломеров первыми были проклонированы теломеры тетрахимены. В макронуклеусе этого объекта имеется большое количество кластеров рДНК, представленных в виде линейных молекул с теломерами на концах. Была сконструирована плазмида, содержащая репликатор и теломерные участки тетрахимены, которая стабильно реплицировалась в дрожжах в виде линейной молекулы ( Szostak, Blackburn, 1982 ). Затем были клонированы теломеры из хромосом дрожжей. Для этого из плазмиды удаляли один теломерный участок тетрахимены и на его место присоединяли разные фрагменты из хромосом дрожжей. Включение теломера дрожжей идентифицировали по способности плазмиды стабильно воспроизводиться в линейной форме в клетках- трансформантах ( Szostak, Blackburn, 1982 ).
Отклонированные таким образом участки размером 2,2-2,6 т.п.н. представляли собой терминальные участки теломера. Их было достаточно для стабилизации плазмиды. Клонируя ARS-элементы , обнаружили класс умеренно повторяющихся, расположенных в теломерных областях ( Chan, Tye, 1980 ; Chan, Tye, 1983a ). Авторы с помощью рестрикционного анализа и гибридизации по Саузерну выяснили, что эти ARS-элементы связаны с двумя типами последовательностей, X и Y, определенным образом организованных в концевых участках хромосом ( Chan, Tye, 1983b ).
Благодаря клонированию отдельных элементов теломеров и их рестрикционному анализу удалось выяснить организацию теломеров дрожжей.
Конец теломера представлен участком Т (0,3-0,6 т.п.н.), состоящим из коротких повторов 5'-поли (С1-3A) в направлении от конца теломера к центромеру (а точнее, С2-3A(СA)1-4 в проксимальных участках и С2-3A(СA)1-6 в дистальных участках) ( Wang, Zakian, 1990 ; Shampay et al., 1984 ; Chan, Tye, 1983a ). ( Walmaley, Petes, 1985 ). Для каждого штамма средняя длина участка постоянна, но эти средние длины варьируют в зависимости от штамма. Средние длины теломеров разных хромосом одного и того же штамма неодинаковы, и не зависят от размера хромосомы. Показано, что в пределах участка Т есть два домена. Проксимальный - одинаков у всех выделенных теломеров. Дистальный сильно варьирует у одного и того же штамма ( Wang, Zakian, 1990 ). В пределах участка Т имеется ряд одноцепочечных разрывов ( Szostak, Blackburn, 1982 ; Chan, Tye, 1983a ).
Проксимальнее участка Т локализована консервативная последовательность Y (6,7 т.п.н.), которая встречается в большинстве теломеров в количестве до четырех копий на теломер ( Chan,Tye, 1983a ). Y может отсутствовать у некоторых штаммов в некоторых хромосомах ( Jager, Philippsen, 1989 ). Проксимальнее Y находится (но не во всех теломерах) менее консервативный участок Х (0,3 - 3,75 т.п.н.), который также содержит ARS-элементы ( Chan,Tye, 1983a ). Между последовательностями Y и X находится участок, представленный повторами С1-3A, однако длина этого участка меньше, чем участка Т - 50-130 п.н. ( Walmaley et al., 1984 ).
Концевой участок Т необходим для функции теломеров. Что же касается теломерассоциированных последовательностей Y и Х, то их назначение неясно. Их количество варьирует в разных хромосомах одного и того же штамма, а также в различных штаммах. Могут встречаться хромосомы, вообще лишенные Х и Y ( Jager, Philippsen, 1989 ). Видимо, Х и Y не являются необходимыми непосредственно для функции теломера.
Теломеры проклонированы у многих других объектов ( Zakian, 1989 ). Теломеры различных объектов могут функционировать в дрожжах, что свидетельствует об их функциональной консервативности. Единственный сходный у всех теломеров элемент - короткие концевые повторы. Видимо, с их наличием связана функция теломеров. Все эти повторы содержат СA, но конкретная последовательность различается у разных объектов.
Показано, что в дрожжах может накапливаться до 400 копий теломеросодержащих плазмид без существенного вреда для клетки ( Runge, Zakian, 1989 ).
