Инициация репликации хромосом

Организацию репликонов исследуют методами авторадиографии. Временной порядок репликации определяют также с помощью гибридизации по Саузерну: в различные моменты S-фазы выделяют ДНК, синтезированную в присутствии метки 15N (при этом реплицированные гибридные молекулы можно отделить от нереплицированных по изменению плавучей плотности). ДНК гибридизуют со специфическими пробами. Так можно зарегистрировать момент появления той или иной последовательности в препаратах ДНК, а значит, момент ее репликации. В экспериментах используют синхронные культуры.

Скорость движения репликационной вилки у дрожжей: 3,6 т.п.н./мин. ( Rivin, Fangman, 1980 ).

В дрожжевых хромосомах ARS-элементы находятся на расстоянии 30-40 т.п.н., по оценке доли рестрикционных фрагментов определенного размера, содержащих ARS-элементы ( Chan, Tye, 1980 ). Соответственно можно рассчитать, что всего на геном дрожжей приходится около 350 ARS-элементов. В некоторых районах генома ARS-элементы кластерированы, так, например, в хромосоме III найдены два кластера ARS-элементов со средним расстоянием между ними 18 т.п.н. ( Newlon, 1988 ).

Однако, далеко не все ARS-элементы, выявленные по функционированию на плазмидах, работают в хромосоме. Пока неясно, существуют ли ARS-элементы, полностью "молчащие" в хромосоме, или любой ARS-элемент может активироваться в определенных условиях. О том, что ARS-элементы варьируют по эффективности, свидетельствуют данные о сравнении стабильности плазмид с различными ARS- элементами. Наиболее убедительна работа по исследованию низкоэффективного ARS-элемента рДНК. На основании оценки стабильности плазмиды в селективных условиях рассчитали, что эффективность активации ARS-элемента рДНК на клеточный цикл меньше единицы. Добавление дополнительного ARS-элемента рДНК повышает стабильность плазмиды - очевидно, за счет более эффективной репликации ( Kouprina, Larionov, 1983 ). Высокоэффективные ARS- элементы активируются один раз за клеточный цикл ( Zakian, Kupfer, 1982 ). Объединение двух эффективных ARS-элементов на одной плазмиде не повышает ее стабильность, вероятно, максимальная эффективность репликации достигается при наличии одного ARS- элемента. Не все ARS-элементы хромосомы активируются в каждом клеточном цикле. При изучении репликации кластера рДНК показано, что большинство ARS-элементов не функционируют (один репликон обычно охватывает 3-10 повторов рДНК , несмотря на то, что ARS- элементы есть в каждом повторе ( Linskens, Huberman, 1988 ). В концевом фрагменте левого плеча хромосомы III присутствуют пять ARS-элементов и шестой ARS-элемент в пределах теломера , но инициация преимущественно происходит с ARS-элементом A6С, причем проксимальная часть репликона - не менее 14,9 т.п.н., дистальная - не менее 38,4 т.п.н. При использовании определенных клеточных линий или температуры инкубирования, могут также активироваться еще два ARS-элемента, расположенные дистальнее A6С ( Newlon, 1988 ; Umek et al., 1989 ).

ARS-элементы теломеров, видимо, неактивны и на плазмидах ( Wellinger, Zakian, 1989 ) и в хромосоме ( Umek et al., 1989 ). Пока ни при каких условиях не показана активация репликации в хромосоме ARS-элементом HML, и еще несколькими ARS-элементами хромосомы III ( Umek et al., 1989 ). Возможно, это полнлстью молчащие ARS- элементы. При этом HML является сильным ARS-элементом на плазмиде.

Таким образом и сами ARS-элементы могут различаться по эффективности, и хромосомный контекст оказывает влияние на их экспрессию. Биологический смысл существования слабых ARS-элементов понятен в случае кластера рДНК, в каждом из повторов которого есть ARS-элементы. Одновременная активация большого количества ARS- элементов, находящихся на близком расстоянии приводила бы к избыточной репликации кластера. Дифференциальная регуляция активности ARS-элементов, возможно, связана с необходимостью адаптации репликации к условиям внешней среды, скорости роста культуры и т.п., а также с регуляцией экспрессии на уровне структуры хроматина. Молчащие ARS-элементы, возможно, являются сайтами связывания с ядерным матриксом и выполняют только одну из двух функций ARS-элементов: регуляцию структуры хроматина. Исследовали элемент ARS1, локализованный на плазмиде. Кор- последовательность элемента ARS1 была свободна от белков, в области домена С находилась нуклеосома. Получая делеции в домене С, добились того, что кор-последовательность попадала в область нуклеосомы. Таким образом, для успешного функционирования ARS- элементов необходимо экспонирование кор-последовательности ( Simpson, 1990 ). Во-вторых, большинство исследованных ( Esposito et al., 1982 ; Greider, Blackburn, 1989 ) ARS-элементов находятся ниже по течению от открытых рамок скатывания, то есть вблизи участков терминации транскрипции. Если в плазмиде близко от ARS-элемента находится промотор GAL1 , то при его активации стабильность плазмиды снижается, а при встраивании терминатора и при росте в условиях индукции GAL1 - восстанавливается ( Snyder et al., 1988 ).

Возможно также, что эффективность активации ARS-элементов зависит от присутствия регуляторных белков. В случае их специфичности для различных типов ARS-элементов, лимитированное количество таких белков в клетке может приводить к тому, что не все ARS-элементы данного типа будут активироваться в одной S-фазе. Функция этих белков может быть связана, например, с облегчением расплетения ДНК в области инициации репликации. На плазмидах расплетение ARS-элементов облегчено ( Umek, Kowalski, 1988 ), поэтому репликаторы, не работающие в хромосоме из-за отсутствия активаторных белков, могут функционировать на плазмиде.

Разные районы хромосом реплицируются не одновременно ( Rivin, Fangman, 1980 ; Burke, Fangman, 1975 ). Центромеры реплицируются на стадии ранней, а теломеры - поздней S-фазы. Подробно исследован район поздней репликации в хромосоме V . При встройке в хромосому V раннего ARS-элемента, он инициируется в поздней S-фазе. Поздний элемент ARS8-R1 при переносе из этого района на плазмиду, наоборот, инициируется рано. Следовательно, контроль времени инициации осуществляется хромосомными последовательностями ( McCarroll, Fangman, 1988 ).

Соседство рано и поздно реплицирующихся участков свидетельствует о существовании преград распространения репликационных вилок. Резкий переход от ранней к поздней репликации наблюдается в районе хромосомы III , охватывающем локус HML (10 т.п.н.) ( Reynolds et al., 1989 ). Обнаружен барьер репликации на 3'-конце активно транскрибируемой рДНК ( Brewer, Fangman, 1988 ). Возможно, остановка продвижения репликационной вилки связана с районами активной транскрипции. Предполагают, что в остановке продвижения репликативных вилок могут также участвовать специфические белки или структура хроматина ( Newlon, 1988 ).

Ссылки: