Роль топологии хромосом в сегрегации
Кольцевые минихромосомы стабильнее линейных ( Hieter et al., 1985 ), что объясняют с помощью следующих гипотез. Во-первых, при отсутствии теломеров плазмида связывается с ядерным матриксом только в одной точке - в области центромера , и нет препятствий для связывания центромера с микротрубочками. Во-вторых, кольцевая минихромосома, представляющая собой топологически замкнутый репликон, эффективно образует катенаты при репликации . У кольцевых минихромосом при достижении размера 100 т.п.н. и более стабильность уменьшается, что можно объяснить увеличением частоты обменов между сестринскими хроматидами. Об этом свидетельствуют данные, полученные на природной кольцевой хромосоме III : с увеличением размера повышается частота образования нестабильных дицентрических хромосом, возникающих при обменах между сестринскими хроматидами ( Hieter et al., 1985 ).
Клонирование центромеров позволило конструировать дицентрические хромосомы и минихромосомы. При изучении их сегрегациии выявляют закономерности функционирования центромеров.
Сегрегация дицентрических хромосом в мейозе и митозе подробно изучена у кукурузы. В мейозе центромеры расходятся к разным полюсам, образуя мост, и происходит либо разрыв либо отхождение дицентрической хромосомы к одному из полюсов. В митозе в половине случаев при случайном расхождении сестринских центромеров линейные дицентрики образуют мосты. У кольцевых хромосом после деления центромера за счет сестринского обмена образуется кольцевая дицентрическая хромосома. Это также может привести к нерасхождению сестринских хроматид, или к разрыву. Концы хромосом, образовавшиеся в результате разрыва, рекомбиногенны. Может происходить репарация за счет рекомбинации с нормальным гомологом, или слияние сестринских хроматид. В результате снова образуется дицентрическая хромосома, и вновь повторяется цикл "разрыв, слияние, мост". Поэтому дицентрики в мейозе и кольцевые хромосомы в митозе крайне нестабильны.
У дрожжей были изучены прежде всего дицентромерные плазмиды. Оказалось, что в клетках трансформанта преобладают моноцентрики. Авторы сделали вывод, что центромеры ведут себя независимо, поэтому с высокой частотой происходят разрывы плазмид . При введении дополнительного центромера в хромосому III с помощью интегративной трансформации дицентрик также оказался нестабильным, а в клетках трансформанта удалось обнаружить только моноцентрические производные хромосомы III ( Surosky, Tye, 1985 ). Моноцентрические хромосомы возникли за счет рекомбинации по повторам, приводящей к исключению одного из центромеров ( Koshland et al., 1987 ; Surosky, Tye, 1985 ), или за счет разрыва хромосомы ( Koshland et al., 1987 ; Haber et al., 1984 ). Рекомбинация по повторам также может быть индуцирована разрывами. При введении в хромосому III дополнительного центромера CEN3 под промотором GAL1 на глюкозе она функционировала как дицентрическая, на галактозе как моноцентрическая. Авторы могли регистрировать момент появления перестроек с помощью пульс-фореза. Оказалось, что хромосома с перестройкой появляется после двух генераций на глюкозе. Реципрокные продукты не были обнаружены, и авторы предположили, что все рекомбинационные события индуцированы разрывами при сегрегации центромеров дицентрической хромосомы ( Hill, Bloom, 1989 ).
Дицентрики стабилизируются, если центромеры сближены: находятся на расстоянии 96 п.н.- 1 т.п.н. ( Koshland et al., 1987 ). Видимо, в этом случае оба центромера влияют друг на друга и выступают как единое целое.
Необычной оказалась стабильность дицентромерных плазмид и хромосом в мейозе ( Haber et al., 1984 ; Haber, Thorburn, 1984 ). Авторы сконструировали кольцевую хромосому III с делецией концевых участков и исследовали рекомбинацию этой хромосомы с нормальной хромосомой III. Кольцевая хромосома была маркирована URA3 , линейная MAL2 .
Рекомбинация кольцевой хромосомы с линейной должна приводить к образованию дицентрической хромосомы (при одиночных обменах). В мейозе были обнаружены тетрады с четырьмя (22%) и тремя (28%) жизнеспособными спорами. В первом случае рекомбинации либо не происходило, либо происходили двойные обмены. В тетрадах с тремя аскоспорами одна из аскоспор Ura+Mal+ была нестабильна по этим признакам. Судя по анализу стабильных продуктов ее сегрегации, аскоспора исходно содержала дицентрическую хромосому, возникшую при одиночном обмене. Следовательно, в мейозе дицентрик относительно стабилен. В 28% тетрад он отходит в одну из двух дочерних клеток и в первом и во втором делении мейоза и после второго деления образуются три жизнеспособных аскоспоры: две родительские (с линейной хромосомой, с кольцевой хромосомой) и одна из двух рекомбинантных - с дицентриком. Получается, что в первом делении мейоза происходит преждевременное деление центромера по крайней мере одного гомолога. Во втором делении мейоза дицентрик и нормальная хромосома должны разойтись к разным полюсам.
Авторы отмечали, что кольцевые дицентрические хромосомы, образующиеся в мейозе из кольцевых моноцентриков за счет сестринских хроматидных обменов, также оказываются стабильны. Разрывы и сегрегация дицентриков происходят только в митозе. Частота сестринских хроматидных обменов - около 15% на кольцевую хромосому (450 т.п.н.).
