Способы получения хромосомных перестроек
Перестройки возникают за счет гомологичной рекомбинации повторяющихся элементов генома, например мобильных элементов ( Chaleff, Fink, 1980 ). Возможно также, что перестройки могут появляться при рекомбинации по теломерным повторам. Так, например, предположительно семейство генов SUC эволюционировало за счет дупликаций исходного гена, локализованного в теломерном районе ( Carlson et al., 1985 ). Хромосомные перестройки возникают у дрожжей с низкой частотой, так как их доля среди спонтанно возникающих мутаций невелика. Тем не менее, в некоторых районах, обрамленных Ту-элементами или дельта-элементами, частота перестроек превышает среднюю по геному. Например, в области DEL1 частота спонтанных делеций достигает от 10 в минус 5 до 10 в минус 6 степени, при обычной частоте 10 в минус 8 до 10 в минус 9 степени ( Liebman et al., 1981 ).
DEL1 - это область в 13 т.п.н., обрамленная элементом Ту1 , в ней находятся гены CYC1 , RAD7 и OSM1 . Рекомбинация между Ту1 приводит к делеции этой области. Показан также неравный кроссинговер между двумя элементами Ту в хромосоме III , приводящий к дупликациям и делециям с частотой 10 в минус 7 степени.
До недавнего времени способов селекции перестроек практически не существовало. Исключение составляли упомянутые выше штаммы DEL1 и инсерция Ту в ген his4 (his4-912). В последнем случае многообразные хромосомные перестройки получили, отбирая у таких штаммов реверсии к прототрофности по гистидину ( Сhaleff, Fink, 1980 ).
В настоящее время разработаны генноинженерные методы получения перестроек. Удвоение различных участков генома получают методом интегративной трансформации . Рекомбинация по гомологии приводит к образованию тандемных дупликаций. Для получения нетандемных дупликаций в плазмиде должны быть гомологии с несколькими участками генома, - например, проклонировано два гена. Преимущественная интеграция по одному из генов будет достигнута, если перед трансформацией внести в этот ген двунитевой разрыв. Тогда штаммы с интегрированной плазмидой будут содержать тандемную дупликацию одного гена (того, по которому происходила интеграция ) и нетандемную дупликацию второго гена. Рекомбинация в нетандемных дупликациях может приводить к появлению инверсий, делеций и транслокаций ( Potier et al., 1982 ; Fasullo, Davis, 1988 ).
Лучшая система отбора перестроек позволяет индуцировать их по желанию экспериментатора. Так например, в хромосомы встраивали участки плазмиды pSR1 Zygosaccharomyces rouxii (RS-сайты), по которым возможна сайт-специфическая рекомбинация. Плазмида pSR1 подобна 2 мкм-плазмиде сахаромицетов. Одновременно в клетки вводили ген R, кодирующий рекомбиназу, под промотором GAL1 . На среде с галактозой можно вызвать индукцию гена R, вследствие чего будет происходить сайт-специфическая рекомбинация по RS-сайтам в хромосомах. Авторы показали, что при культивировании на галактозе 80% клеточной популяции приобретают перестройку. Наличие перестроек регистрировали методами рестрикционного анализа и пульс-фореза ( по появлению в геле дополнительных полос, соответствующих перестроенным хромосомам ). Авторы указывают на то, что, имея один из RS-сайтов на плазмиде (кольцевой или линейной ), а другой в хромосоме, можно получать в хромосомах крупные делеции с известным расположением концов, а также включать крупные фрагменты ДНК в плазмиду и в хромосому.
Природные хромосомы можно изменить и другими способами. Трансформация интегративными плазмидами, содержащими центромер, приводит к возникновению дицентрических хромосом , обычно нестабильных ( Surosky, Tye, 1985b ). Для изучения их свойств, с хромосомой интегрируют центромер, функционирующий только в определенных условиях (центромер под галактозным промотором)
Разработана также методика замены центромеров в природных хромосомах. Сконструирован вектор, в котором можно проклонировать любой центромер между двумя участками, фланкирующими центромер хромосомы III . Трансформацию проводили фрагментом вектора с центромером и фланкирующими участками. Интеграция происходила только при двойной рекомбинации по фланкирующим участкам, с заменой хромосомного центромера на плазмидный ( Clarke, Carbon, 1983 ). Эту методику используют не только для встройки негомологичных, но и мутантных центромеров.
Тот же принцип используют для получения укороченных хромосом (хромосом с крупными концевыми делециями одного или обоих плеч) ( Surosky, Tye, 1985a ; Vollrath et al., 1988 ).
Возможно также создать кольцевые формы природных хромосом, первая из которых была получена in vivo при реципрокной рекомбинации между МAТа и НМLalfa . Эта хромосома нестабильна, несет крупные концевык делеции и клетки жизнеспособны только при наличии нормальной хромосомы III ( Strathern et al., 1979 ). Рекомбинация приводит к активации информации HMLalfa и переключению типа спаривания а -> alfa. Поэтому штаммы с такой кольцевой хромосомой можно отобрать в опытах по "незаконной" гибридизации а х а, возможной при переключении типа спаривания у одного из партнеров.
На основе хромосомы III сконструировали еще одну кольцевую хромосому, которая маркирована URA3 , и не приводит к летальности в гемизиготном состоянии, так как делетирован очень небольшой фрагмент. Поэтому ее весьма удобно использовать в генетических исследованиях ( Haber et al., 1984 ).
