Транскрипционные активаторы
В последнее время выявлены и очищены белки, связывающиеся с ARS , TEL и CEN . Как оказалось, эти белки могут служить транскрипционными активаторами в промоторах ряда генов, некоторые из них являются компонентами ядерного матрикса .
В грубых экстрактах дрожжевых клеток присутствуют два белка, связывающиеся с сайленсерами, теломерами, ARS и UAS ( Buchman et al., 1988 ; Shore et al., 1987 ). В ранних работах эти факторы выступали под разными названиями, теперь принято называть их RAP1p и ABF1p . Белки вскоре были очищены, появилась возможность исследовать их связывание с различными последовательностями ( ARS , CEN , TEL , сайленсерами UAS ). С помощью футпринтинга ДНК-азой 1, метилазной протекции удалось выявить сайты связывания этих белков и вывести для них обобщенные последовательности.
Фактор ABF1p очищен, это белок с молекулярным весом 135 кД ( Sweder et al., 1988 ; Diffley, Stillman, 1988 ). Он связывается со специфической последовательностью, которая найдена в домене B различных ARS ( ARS1 , ARSHMR-E ) и необходима для репликации .
Удивительно, что эта же последовательность находится в промоторах некоторых рибосомных, митохондриальных белков, белков, связанных с транскрипцией, beta-тубулина , CDC5p , CDC16p , кальмодулина (всего 58 сайтов - по данным компьютерного анализа в банке нуклеотидных последовательностей) ( Dorsman et al., 1989 ). Показано также, что B-домен ARS может функционировать как UAS ( Brand et al., 1987 ).
Ген ABF1 отклонирован ( Rhode et al., 1989 ). Как оказалось по данным секвенирования, ABF1 кодирует белок из 731 аминокислотного остатка, с молекулярным весом 82 кД, то есть значительно меньшим, нежели предполагается у белка, выделяемого из экстрактов. Видимо, это связана с аномальной миграией белка в полиакриламидном геле. В ABF1p имеется домен "цинковых пальцев", характерный для белков, связывающих однонитевую ДНК. Дизрупция ABF1 приводит к летальности. ABF1 был локализован в хромосоме V с помощью пульсфореза ( Rhode et al., 1989 ).
Белок ABF1p может быть идентичен SUF , TAF , SBF-B , GF1 , TyBF , так как эти белки обладают сходным молекулярным весом и связываются с одними сайтами ( Eisenberg et al., 1988 ). Но гены для этих белков еще не клонированы, так что окончательные выводы делать рано.
Выделен белок OBF1p , связывающийся с ARS теломеров и ARS1. Этот белок узнает ту же последовательность, что и ABF1p ( Eisenberg et al., 1988 ; Walker et al., 1989 ). Несмотря на то, что OBF1 очень сходен с ABF1p , свойства проклонированного гена заставляют предположить, что это другой фактор. Показано, что OBF1 локализуется в хромосоме IV , рестрикционная карта проклонированного фрагмента отличается от ABF1, как и размеры транскрипта. Секвенирование проклонированного фрагмента не проводили ( Biswas et al., 1990 ).
Белок RAP1p (92 кД) был выделен и очищен, а соответствующий ген клонирован ( Shore, Nasmyth, 1987 ). Этот белок участвует в транскрипционной активации, его сайты связывания находятся в промоторах многих генов, в том числе в промоторе MAT и в промоторах генов рибосомных белков ( Buchman et al., 1988 ).
Сайты связывания RAP1 находятся в дрожжевых теломерах (участок T) ( Longtine et al., 1989 ; Buchman et al., 1988 ). Теломерные последовательности C1-3A могут выступать в качестве транскрипционных активаторов химерного гена CYC-lacz на плазмидах ( Runge, Zakian, 1990 ). Показано, что RAP1 необходим для функционирования теломеров, так как сверхэкспрессия RAP1 на многокопийной плазмиде приводит к увеличению длины теломеров, потерям хромосом и увеличению частоты рекомбинации ( Zakian et al., 1990 ). Высказана гипотеза, что RAP1p необходим для транскрипции C1-3A-повторов. Эта РНК используется в качестве затравки теломерной трансферазой ( Runge, Zakian, 1990 ).
Выделен и очищен белок CBP1 (39,4 кД) связывающийся с центромерной ДНК элемента CDE1 ( Jiang, Philippsen, 1989 ; Baker et al., 1989 ; Cai, Davis, 1989 ; Dorsman et al., 1989 ; Bram, Kornberg, 1987 ). Как оказалось, белок связывается не только с CDE1, но и с промоторами многих генов ( Jiang, Philippsen, 1989 ; Dorsman et al., 1989 ). Так, например, CBP1 исходно был выделен по способности связываться с промоторами генов, кодирующих митохондриальные белки ( Dorsman et al., 1989 ). Благодаря этому удалось вывести обобщенную последовательность, с которой связывается этот белок.
Ген, кодирующий CBP1 ( CEP1 ), клонирован ( Amati, Gasser, 1988 ). Его дизрупция приводит к замедлению роста культуры и повышению частоты потерь хромосом в митозе , но не в мейозе (как и ожидается при нарушении функции CDE1). Появляется ауксотрофность по метионину, следовательно CER1p является транскрипционным активатором in situ - его сайты связывания находятся в промоторах генов биосинтеза метионина .
Таким образом оказывается, что ABF1p, RAP1p, CBP1p могут выступать в зависимости от хромосомного контекста и как активаторы, и как репрессоры транскрипции. ABF1p необходим для репликации, RAP1p - для функции теломеров, CBP1p - для функции центромеров.
Каким же образом один белок может выполнять столь разнообразные функции? По одной из гипотез эти белки в той или иной степени взаимодействуют с ядерным матриксом и регулируют функции репликации, сегрегации и транскрипции, модифицируя структуру хроматина. Действительно, сайты связывания белков находятся в теломерах, центромерах, ARS-элементах. RAP1p является компонентом ядерного матрикса ( Amati, Gasser, 1988 ; Hoffmann et al., 1989 ). Белок ABF1p не был выделен в комплексе белков матрикса, но плазмиды, содержащие сайт связывания ABF1p, ассоциированы с ядерным матриксом ( Chambers et al., 1990 ). Возможно, взаимосвязь ABF1p с матриксом слабая или опосредована другими белками. Следует отметить, что HM-локусы - пока единственный пример, когда RAP1p и ABF1p участвуют в регуляции транскрипции крупного блока хромосомы , и эта регуляция каким-то образом связана со структурой хроматина.
Вместе с тем, сайты связывания RAP1p , ABF1p , CBP1p встречаются слишком часто, чтобы во всех случаях служить для взаимодействия с матриксом. Это позволяет предположить, что они оказывают влияние не на структуру хроматина, а скорее на сборку инициирующего комплекса. Наиболее вероятно, что эти белки входят в состав белковых комплексов, и их функция может модифицироваться. Пример подобных взаимодействий - транскрипционный активатор PRTF , который может образовывать комплексы с белками alfa1, STE12p. По этой гипотезе предполагаемая функция ABF1p, RAP1p, CBP1p связывание регуляторного белкового комплекса (или ядерного матрикса, гистонов, репликативного комплекса) с ДНК.
Кроме уже упомянутых выявлены также несколько белков, имеющих отношение к функционированию хромосом, но изученных менее подробно.
Это, во-первых, белок ядерного матрикса, связывающийся с кор-последовательностью ARS (возможно, несколько разных белков с молекулярным весом 50-70 кДа) ( Gasser et al., 1990 ).
Кроме того, проклонированы гены ABF2 ( Diffley, Stillman, 1990 ) и ACP2 ( Haggren, Kolodrubetz, 1988 ), которые, видимо, кодируют белки типа HMG . Ранее было обнаружено несколько белков дрожжей, сходных по электрофоретической подвижности и аминокислотному составу с HMG-белками высших организмов ( Smith, Andresson, 1983 ). Белок млекопитающих и гомологичный ему нуклеоплазмин Xenopus laevis, кислый белок, способны in и vitro in vivo связываться со свободными гистонами , но не с ДНК-гистоновыми комплексами. Предполагается, что они препятствуют неспецифическому связыванию свободных гистонов с ДНК. Возможно, белки HMG могут участвовать в транскрипционной активации, а также и в репликации, так как они проявляют большее сходство к однонитевой нежели к двунитевой ДНК.
Ген ACP2 клонировали по гомологии с генами HMG млекопитающих. Дизрупция этого гена приводит к летальности ( Haggren, Kolodrubetz, 1988 ). ABF2 проклонировали как ген для белка, связывающегося с короткими последовательностями в районах, фланкирующих кор-последовательность ARS. Была обнаружена гомология аминокислотной последовательности этого белка с HMG позвоночных ( Diffley, Stillman, 1990 ).
