Тетрадный анализ диплоидов
Расщеплание в тетрадах гетерозиготного гибрида дрожжей, полученного от скрещивания АВхав, приводит к появлению неупорядоченных тетрад трех типов: Р - родительский дитип, N -неродительский дитип и Т - тетратип. При случайном перекомбинировании четырех хроматид возможны шесть равновероятных способов объединения аллелей генов A и В и соответственно ожидается соотношение 1Р:1N:4Т. Оно реализуется при условии свободной рекомбинации между исследуемыми генами и их центромерами (или при свободной рекомбинации хотя бы одного из двух несцепленных между собой генов со своим центромером).
Очевидно, что если гены A и В не рекомбинируют со своими центромерами (но не сцеплены между собою), то тетрады Т отсутствуют. При возможности кроссинговера на участке ген - центромер хотя бы для одного маркера, образуются все три типа тетрад. Если гены A и В не рекомбинируют, то появятся только тетрады Р. Для образования тетрад N и Т необходим кроссинговер. Таким образом, при неполном сцеплении генов A и В со своими центромерами частота тетрад Р (fp) должна быть равна частоте тетрад N (fn), а частота тетрад Т (ft) должна быть меньше 2/3; при неполном сцеплении генов между собой: fp > fn; ft < 2/3.
При расчете гентических расстояний в тетрадном анализе используют соотношения, связывающие генетическое расстояние D и частоту кроссинговера на мейоз бета, где
бета=2D/100 с fn и ft. Если при выведении этих соотношений учитывают какой-либо тип интерференции (хромосомная, хроматидная), генетическое расстояние измеряют в сантиморганидах (сМ) . Если интерференцией пренебрегают, то соответствующая единица генетической рекомбинации - стрейн .
Предположив наличие хиазменной интерференции (только одиночные и двойные обмены) и отсутствие хроматидной (все типы двойных обменов равновероятны), выводят следующее соотношение для определения расстояния между генами A и В:
Dab=(0,5ft+3fn)100 (сМ) [1]
При этом исходят из следующих соображений: только происхождение тетрад N можно определить однозначно, частота мейозов, в которых произошло два обмена - 4fn, частота мейозов, в которых произошел один обмен - ft-2fn. Таким образом,
бета=2(4fn )+ft-2fn, а D=50бета ( Perkins, 1949 ).
В случае расчета расстояния между генами, без учета интерференций предполагают пуассоново распределение одиночных, двойных и т.д. обменов на мейоз, и бета вычисляют, исходя из частоты мейозов, в которых не произошло ни одного обмена ( Desborough, Lindegren, 1959 ). Такие мейозы приводят к образованию тетрад Р.
Другой источник тетрад Р - множественные обмены (число обменов не меньше двух ), и их столько же, сколько тетрад N. Следовательно, частота мейозов, в которых не произошло ни одного обмена fp-fn. Таким образом: fp-fn=е в степени -бета; бета= -ln(fp-fn), и:
Dab=-50ln(fp-fn) ( стр) [2]
При отсутствии интерференции и пуассоновом распределении числа обменов: ft = 2/3(1-е в степени(3/2хбета)); бета=-2/3ln(1-3/2ft); и:
Dab=-33,33ln(1-3/2ft) (cтр) [3]
Величины, выраженные в стрейнах и сантиморганидах, на расстояниях до 10 сМ практически совпадают. На расстоянии свыше 10 сМ значение в стрейнах превышает значение в сМ. На расстоянии до 35-40 сМ вполне можно пользоваться формулой [1] - в этих пределах наблюдается хорошая аддитивность данных карты. На таком отрезке можно реально зарегистрировать сцепление, и необходимый объем выборки не должен быть чрезмерно велик. При расчете расстояний свышн 40 сМ необходимо использование дополнительных уравнений для корректировки вычислений по формуле [1] с учетом реальной интерференции ( Snow, 1979b ), что требует специальной матеиатической обработки. Стандартную генетическую карту составляют с помощью этих формул. Хорошее приближение к этим фомулам дает выражение ( Ma, Mortimer, 1983 ):
Dab=[80,7D-(0,883D) в квадрате]/(83,3-D) (сМ); [4]
где D - расстояние по фомуле [1].
Расстояние ген - центромер определяют, исходя из частоты сегрегации при втором делении мейоза (fII). Это частота, с которой разные аллели одного гена ( А и а ) в результате кроссинговера оказываются сцепленными с одним центромером. Тогда расхождение А и а к разным полюсам происходит только при втором делении мейоза. По сути дела, fII - это частота тетратипов по гену и его центромеру.
Если fII известна, то расстояние между геном и центромерой
Doa=-33,33(1-1,5fII) (cтр) [5]
Doa=0,5fII (cM) [6]
В последнем случае не учитываются акты рекомбинации, которые не ведут к сегрегации при втором делении (например, двойные обмены в двух и четырех нитях на участке ген-центромер), что приводит к недооценке вклада множественной рекомбинации на больших расстояниях. Использование формулы [5] на больших отрезках приводит к завышению генетического расстояния, так как интерференция в прицентромерных районах составляет в среднем 0,3. Поэтому применение [5] и [6] рекомендуется на расстояниях до 20 сМ, а на больших расстояниях необходимо вносить поправки ( Snow, 1979b ).
Проблема состоит в том, чтобы определить fII. Для двух маркеров, находящихся в разных хромосомах
ft=fIIа+fIIв-1,5fIIа x fIIв [7]
Лучше всего использовать в скрещивании тестерный маркер, тесно сцепленный с центромером : trp1 (0,45 cM), met14 (2,6 cM), leu1 (3,1 cM), met3 (3,3 cM), ade1 (4,0 cM). В этом случае подавляющее большинство Т появится в результате рекомбинации картируемого маркера со своим центромером.
Если fIIв=0, то ft= fIIa.
Если невозможно ввести в скрещивание тестерный маркер с известным расстоянием ген-центромер, то нужны два маркера, сцепленные с центромером, в дополнение к картируемому. Тогда из частот тетратипов для каждой пары маркеров можно вычислить fIIa, fIIb, fIIc. Из-за громоздких вычислений, этим способом не пользуются, а предплчитают рассчитывать условное расстояние
Dab=Doa+Dob в стрейнах по формуле [3]. (Формула [2] не годится, так как в нее входит fn, а в данном случае появление тетрад N не связано с рекомбинацией ген-центромер). Вычислив Dab, Dac, Dbc, расстояние Doa находят из уравнения:
Doa=(Dab+Dac-Dbc)/2 [9]
Аналогично можно вычислить Dob и Doc ( Инге-Вечтомов, 1971 ).
Приведенные выше способы позволяют рассчитывать расстояние ген-центромер, если все маркеры находятся на разных хромосомах.
Если два маркера сцеплены, то это расстояние вычисляют иначе. Предположим, что гены A и В сцеплены, а ген С с ними не сцеплен, тогда для пар A-С и В-С справедливо [7]. Если A и В находятся по разные стороны от центромера, то
ft=fIIa+fIIb [10]
Ecли A и В находятся в одном плече, то, в зависимости от того, A или В является дистальным маркером,
ft=fIIa-fIIb [11], или
ft=fIIa-fIIb [12]
Для того, чтобы решить систему из трех уравнений и найти fII из ft, вводят вспомогательные величины:
Q=1-1,5ft, которую можно рассчитать из данных эксперимента, и
y=1-1,5fII, и тогда
fII=0,67(1-Y) [13]
Если принять [10], то
Ya=Qac/Yc; Yb=Qbc/Yc; Yc=(Qac+Qbc)/(1-Qab)
Рассчитав Yc, а затем Yb и Ya, можно получить fIIc, fIIb, fIIa, а затем генетические расстояния по формулам [5] и [6].
