Гены, регулирующие споруляцию
Отобраны мутации , приводящие к споруляции диплоидов a/a и alfa/alfa, т.е. нарушающие контроль споруляции со стороны локуса MAT . При этом использовали гетерозиготы по генам cyh2 и can1, клоны которых, полученные из обработанных мутагеном клеток, выносили на среду для споруляции и перепечатывали на среду с канаванином и циклогексимидом. Мутанты, способные к споруляции, должны в этих условиях образовывать гаплоидные сегреганты устойчивые к канаванину и циклогексимиду. Так были получены мутации csp1 ( Hopper, Hall, 1975 ; Hopper et al., 1975 ) и rme1 ( Kassir, Simchen, 1976 ).
Ген RME1 аллелен гену CSP1 . Было высказано предположение, что это ингибитор мейоза. Ген RME1 был картирован и клонирован ( Mitchell, Herskowitz, 1986 ; Rine et al., 1981 ). Клонирование этого гена провели в гомозиготном по мутации rme1 и гетерозиготном по мутациям can1 и cyh2 диплоиде mata1/MATalfa, который способен к споруляции, что можно выявить по появлению гаплоидных сегрегантов CanrCyhr. Такой диплоид трансформировали банком дрожжевых генов и искали клоны, неспособные к выщеплению сегрегантов CanrCynr на среде с канаванином и циклогексимидом.
Как оказалось, в клетках a/alfa количество мРНК гена RME1 снижено в 20 раз по сравнению с таковым у штаммов а/а и alfa/alfa. При сверхэкспрессии гена RME1 на многокопийных плазмидах нарушается мейотическая рекомбинация и образование спор у диплоидов а/alfa. При дизрупции гена RME1 диплоиды а/а и alfa/alfa приобретают способность к споруляции. Это подтверждает гипотезу о гене RME1 как ингибиторе мейоза и свидетельствует о том, что транскрипция этого гена находится под контролем локуса МАТ. Отмечено, что мутации rme1 не приводят к споруляции на полной среде. Следовательно, контроль споруляции в зависимости от внешних условий осуществляется позднее этапа, на котором действует ген RME1.
Был проклонирован ген IME1 , благодаря тому, что увеличение его дозы приводит к споруляции клеток а/а и a/alfa. Гомозиготы по дизрупции этого гена не могут осуществлять мейоз из-за остановки на стадии G1 . Таким образом, ген IME1 кодирует активатор мейоза, в противоположность гену RME1. Двойные мутанты ime1rme1 проявляют фенотип, свойственный мутантам ime1. Следовательно, ген IME1 действует на более поздней стадии, чем ген RME1. В дальнейшем было обнаружено, что ген RME1 подавляет экспрессию гена IME1. При подавлении транскрипции гена RME1 в клетках а/alfa или у мутантов rme1 экспресситуется индуктор споруляции IME1. Споруляция при увеличении дозы гена IME1 возможна и на полной среде, т. е. именно на этапе действия гена IME1 объединяются контроль споруляции локусом МАТ и условиями внешней среды ( Kassir et al., 1988 ).
Выявлен еще один ген, находящийся под контролем гена IME1: IME2 . Авторы предприняли поиск генов, стимулирующих споруляцию у клеток а/alfa, содержащих мультикопийную плазмиду с геном RME1, и поэтому неспособных к споруляции. При трансформации банком генов дрожжей, находящимся на мультикопийной плазмиде, клонировали, как и следовало ожидать, ген IME1, а также еще один ген - IME2. Многокопийная плазмида с геном IМЕ2 частично компенсирует дефект споруляции у мутантов ime1. Дизрупция гена IME2 подавляет споруляцию. Авторы заключили, что ген IME2 действует позже гена IME1. Гомозиготность по мутации ime2 не сказывается на уровне транскрипции гена IME1. Зато в клетках ime1/ime1 транскрипция гена IME2 составляет менее 1% от уровня дикого типа. Следовательно, ген IME1 индуцирует транскрипцию гена IME2 ( Smith, Mitchell, 1989 ).
Ген IME2 был отклонирован вторично как стимулятор споруляции на полной среде у диплоидов МАТа/МАТalfa. Авторы секвенировали этот ген и обнаружили, что он кодирует протеинкиназу ( Yoshida et al., 1990 ).
У гомозигот по мутации ime2 наблюдается более длительный период экспрессии гена IME1 при голодании , поэтому, возможно, что ген IME2 - это негативный регулятор, сокращающий период экспрессии гена IME1 ( Smith, Mitchell, 1989 ). Предполагают, что ген IME1 находится под посттранскрипционным контролем и контролем по механизму обратной связи.
Данные по изучению фенотипа гиперморфов IME2 свидетельствуют о том, что ген IME1 непосредственно регулирует не только ген IME2, но и другие гены. Во-первых, гиперэкспрессия гена IME2 лишь частично компенсирует дефект мутации ime1. Во-вторых, у диплоидов МAТа/МAТа, МAТalfa/МAТalfa и mata1/matalfa2 увеличение дозы гена IME2 не приводит к индукции споруляции ( Yoshida et al., 1990 ).
Показано, что у мутантов ime2 ген IME1 необходим для экспрессии генов SPO11 , SPO13 , SPS2 , SPS1 . Ген IME2 может индуцировать эти гены и в отсутствии IME1, но для полной экспрессии неоходимо одновременное действие этих генов. Авторы предположили, что может существовать несколько параллельных путей активации генов, специфичных для споруляции, эффект которых суммируется. Из-за избыточности путей регуляции мутации во многих генах, специфичных для споруляции не оказывают существенного влияния на фенотип. Делеция гена IME2 приводила к увеличению периода экспрессии генов SPO12 и SPO13 ( Strich et al., 1989 ).
Отобраны мутанты по пяти генам UME, у которых на среде с глюкозой возможна экспрессия генов SPO11, SPO13, SPO16 , но не SPO12 и SPO2 . Эти негативные регуляторы могут входить в регуляторный каскад IME1-IME2 ( Strich et al., 1989 ).
