Эписомная дестабилизация хромосом
Метод, получивший большое распространение для определения группы сцепления новых мутаций - это гаплоидизация , индуцированная интеграцией фрагментов 2 мкм-плазмиды в хромосомы . В норме плазмида с хромосомой не интегрирует, так как у них нет областей гомологии. Если же создать область гомологии искусственно, - встроить дрожжевой ген, - то можно отобрать интегранты ( Holmberg et al., 1982 ). Для дестабилизации необходимо, чтобы в хромосоме было несколько инвертированных повторов плазмиды, по которым происходит сайт-специфическая рекомбинация (рис.6 ). Выявить этот эффект можно, трансформируя диплоиды, для которых потеря одного из гомологов не ведет к летальности. Гаплоидные интегранты жизнеспособны, так как нуллисомиками становятся не все клетки популяции.
Картирование мутаций проводят следующим образом. Получен набор тестеров с интеграцией 2-мкм плазмиды в разные, заранее известные хромосомы. Скрещивая любой вновь полученный мутант с тестерами, можно по выходу мутации в гемизиготу определить, в какой группе сцепления она находится ( Булат и др., 1983 ).
Этот метод позволяет решить проблему картирования проклонированных в векторах YEp фрагментов с неизвестной функцией. Такие фрагменты ( в составе вектора ) интегрируют по гомологии с хромосомной последовательностью, что приводит к дестабилизации этой хромосомы. Интегранты скрещивают с тестерными гаплоидными штаммами, маркированными по каждой хромосоме рецессивными мутациями. О локализации фрагмента в определенной хромосоме судят по выходу в гемизиготу рецессивного маркера этой хромосомы ( Falco, Botstein, 1983 ).
Как оказалось, часто хромосома не теряется, а претерпевает гомозиготизацию по маркерам дистальнее сайта интеграции, так как образование моста может привести не только к нерасхождению, но и к рекомбиногенным разрывам. При рекомбинации с интактным гомологом происходит восстановление диплоидного состояния и выход дистальных маркеров в гомозиготу. Поэтому дестабилизация позволяет определить плечо, в котором находится картируемый маркер. Если выход в гомозиготу происходит всегда только за счет потерь целой хромосомы, маркер находится проксимальнее сайта интеграции. Если же возможно проявление марекра и при потере плеча, то он находится дистальнее.
Эта же методика позволяет ориентировать гены по отношению к центромеру . Плазмиду интегрируют в область между маркерами, порядок которых по отношению к центромеру нужно определить, и сравнивают частоту выхода в гомозиготу двух генов вместе и по отдельности. При потере всей хромосомы в гемизиготу выходят оба гена, при потере плеча - только один ген, расположенный дистальнее. Таким образом, оценивая, какой маркер выходит в гемизиготу по отдельности, можно выявить дистальный маркер ( Lemmon et al., 1990 ).
