Метод спасения маркера на плазмиде
Мутантные аллели гена RPO21 ( RPB1 ), кодирующего большую субъединицу РНК-полимеразы II , встраивали в хромосому и трансформировали мутанты плазмидами с нормальной копией этого гена. В различных областях аллели дикого типа были предварительно вырезаны с помощью рестриктаз небольшие фрагменты. Все трансформанты несли рекомбинантную плазмиду, так как ее репликация возможна только при репарации бреши за счет рекомбинации с хромосомной копией гена. У трансформантов, отобранных по векторному маркеру (т.е. URA3, LEU2 и т.д.), тестировали фенотип (нормальная или мутантная РНК-полимераза II). Если точковая мутация была вне области бреши, у многих трансформантов происходило восстановление дикого фенотипа, если внутри, то фенотип оставался мутантным . Очевидно, это вариант метода перекрывающихся делеций , но отбор ведут не по исследуемому гену, а по другому селективному маркеру, и только потом исследуют фенотип рекомбинантов по картируемому гену. Почти все рекомбинанты имеют одинаковый фенотип, и для картирования можно исследовать небольшую выборку трансформантов.
Показано, что для картирования таким способом не обязательно интегрировать мутации с хромосомой. Возможна рекомбинация плазмиды с брешью и линеаризованного фрагмента, гомологичного гену на плазмиде. Плазмиду с точковой мутацией в гене HXK2 линеаризовали в 3'-конце или 5'-конце гена. Одновременно вырезали фрагменты из тестерных плазмид, несущих делеции в этом гене. Совместные трансформанты отбирали по векторному маркеру LEU2 и тестировали на фенотип, обуславливаемый мутациями hxk-. Этим способом можно картировать мутации, находящиеся на расстоянии в 22 п.н. Частота "спасения маркера" (т.е. конверсии к дикому типу) пропорциональна расстоянию до области разрыва: чем ближе к области разрыва, тем более вероятна потеря маркера при рекомбинации. Селекция рекомбинантов и метод отпечатков, используемый для их тестирования, позволяют выявлять случаи спасения маркера, происходящие с частотой до 0,1% ( Botstein et al., 1979 ).
