Метод перекрывающихся делеций
При этом методе внутригенного картирования одиночные мутанты скрещивают со штаммами, несущими делеции. Точковая мутация, попадающая в район, охватываемый делецией, не рекомбинирует. Таким образом, этот метод более чувствителен, чем трехсайтовые скрещивания . Показано, что частота рекомбинации точковых мутаций с делецией может различаться в 2-3 раза в зависимости от расстояния между точковой мутацией и концом делеции. И вместе с тем частота рекомбинации на порядок превышает частоту реверсий, даже если это расстояние составляет 25 п.н. ( Rose et al., 1984 ).
Применение метода перекрывающихся делеций долгое время было ограничено, так как спонтанные внутригенные делеции у дрожжей очень редки. Единственное исключение составляла система CYC1 , в которой удалось отобрать делеции весьма своеобразным способом. Были сконструированы аллели CYC1, сильно различающиеся по нуклеотидной последовательности в начале гена. Гетероаллельная рекомбинация между ними протекала аномально и приводила к образованию делеций. Детали этого процесса не совсем понятны ( Sherman et al., 1975 ).
С развитием генноинженерных методов появилась возможность получать делеции практически в любом проклонированном гене, и метод делеционного картирования сейчас широко распространен.
Если ранее концы делеций приходилось картировать по рекомбинации с точковыми мутациями с известной локализацией, то теперь чаще всего их расположение устанавливают секвенированием. В результате метод перекрывающихся делеций дает информацию не только о взаимном расположении мутаций, но и о физическом расстоянии между ними ( Rose et al., 1984 ).
Следует отметить, что метод перекрывающихся делеций имеет ряд ограничений. Во-первых, можно проводить прямой отбор рекомбинантов далеко не по всем генам. Так, например, невозможно непостедственно отселектировать рекомбинанты, восстанавливающие способность к копуляции и т.п. Во-вторых, процедура замещения в хромосоме аллели дикого типа на мутантную весьма трудоемка, что усложняет анализ большой выборки мутаций. Эти сложности устраняются при использовании метода спасения маркера на плазмиде .
